Bir sıçan modelinde ligatür ve lipopolisakkarit enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile periodontitisin indüksiyonu
Summary
Bu çalışmada, periodontitis indüksiyonunun sıçan modeli, ilk maksiller azı dişlerinin etrafında 14 gün boyunca, Porphyromonas gingivalis’ten türetilen tekrarlayan lipopolisakkarit enjeksiyonları ve geciktirici ligatür kombinasyonu ile sunulmuştur. Ligasyon ve LPS enjeksiyon teknikleri peridonti indüklemede etkiliydi, bu da alveoler kemik kaybı ve inflamasyona neden oldu.
Abstract
Periodontitis (PD), periodonsiyumun oldukça yaygın, kronik immün-inflamatuar bir hastalığı olup, dişeti yumuşak dokusu, periodontal ligament, sementum ve alveoler kemik kaybına neden olur. Bu çalışmada, sıçanlarda basit bir PD indüksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Ligatür modelinin ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına yerleştirilmesi ve M1’in mesio-palatal tarafındaki Porphyromonas gingivalis’ten türetilen lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonlarının bir kombinasyonu için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Periodontitisin indüksiyonu 14 gün boyunca korundu ve bakteri biyofilm ve inflamasyon birikimini teşvik etti. Hayvan modelini doğrulamak için, anahtar bir inflamatuar mediatör olan IL-1β, dişeti oluk sıvısında (GCF) bir immünoassay ile belirlendi ve koni ışınlı bilgisayarlı tomografi (CBCT) kullanılarak alveoler kemik kaybı hesaplandı. Bu teknik, 14 gün sonra deneysel prosedürün sonunda dişeti çekilmesini, alveoler kemik kaybını ve GCF’de IL-1β düzeylerinde bir artışı teşvik etmede etkiliydi. Bu yöntem PD’yi indüklemede etkiliydi, böylece hastalık ilerleme mekanizmaları ve gelecekteki olası tedaviler üzerine yapılan çalışmalarda kullanılabiliyordu.
Introduction
Periodontitis (PH), dünya çapında en sık görülen altıncı halk sağlığı durumudur ve toplam popülasyonun yaklaşık %11’ini etkileyen, periodontal hastalığın gelişmiş, geri dönüşümsüz ve yıkıcı bir formudur 1,2. PD, dişeti ve periodontal dokuları etkileyen, dişeti çekilmesi, bileşke epitelinin cep gelişimi ile apikal migrasyonu ve alveoler kemik kaybı ile sonuçlanan inflamatuar bir süreçtir3. Ayrıca, PH kardiyovasküler hastalık, obezite, diyabet ve romatoid artrit gibi çevresel ve konakçıya özgü faktörlerin önemli rol oynadığı çeşitli sistemik hastalıklarla ilişkilidir 4,5.
Bu nedenle, PD esas olarak mikrobiyal plak birikimi ile başlayan multifaktöriyel bir hastalıktır – mikrobiyal toplulukların disbiyozundan kaynaklanır – ve periodontal patojenlere karşı abartılı bir konakçı immün yanıtı ile başlar ve periodontal dokunun parçalanmasına yol açar 4,6. Birkaç periodontal bakteri arasında, gram-negatif anaerobik bakteri Porphyromonas gingivalis, PD4’teki anahtar patojenlerden biridir. P. gingivalis, duvarlarında kompleks bir lipopolisakkarit (LPS), iltihaplı periodontal dokularda polimorfonükleer lökosit infiltrasyonu ve vasküler dilatasyonu indüklediği bilinen bir moleküliçerir 7. Bu, interlökin 1 (IL-1), IL-6 ve IL-8, tümör nekroz faktörü (TNF) veya prostaglandinler gibi enflamatuar mediatörlerin üretilmesiyle sonuçlanır, daha sonra osteoklast aktivasyonu ve kemik rezorpsiyonu ile doku yıkımına ve nihai diş kaybına yol açar3.
Hayvan modellerinin farklı avantajları arasında, insanlarda olduğu gibi hücresel karmaşıklıkları taklit etme veya sınırlı hücre tiplerine sahip plastik yüzeylerde gerçekleştirilen in vitro çalışmalardan daha doğru olma kapasitesibulunmaktadır 8. PD’yi deneysel olarak in vivo olarak modellemek için, insan olmayan primatlar, köpekler, domuzlar, yaban gelinciği, tavşanlar, fareler ve sıçanlar gibi farklı hayvan türleri kullanılmıştır9. Bununla birlikte, sıçanlar PD’nin patogenezi için en çok çalışılan hayvan modelidir, çünkü ucuz ve kullanımı kolaydır10. Diş eti dokusu, insan dişeti dokusuna benzer yapısal özelliklere sahiptir, sığ bir dişeti sulkusu ve diş yüzeyine bağlı bileşke epitelidir. Ayrıca, insanlarda olduğu gibi, bileşke epiteli, bakteriyel, yabancı maddelerin ve eksüdaların enflamatuar hücrelerden geçişini kolaylaştırır 9.
Sıçanlarda PD indüksiyonunun en çok bildirilen deneysel modellerinden biri, teknik olarak zor ama güvenilir olan dişlerin etrafına ligatürlerin yerleştirilmesidir10. Ligatür yerleşimi diş plağı ve bakteri birikimini kolaylaştırır, dişeti sulcisinde periodontal doku iltihabına ve yıkımına neden olan bir dysbiosis oluşturur11. Bu sıçan model8’de periodontal ataşman kaybı ve alveoler kemiğin rezorpsiyonu 7 gün içinde ortaya çıkabilir.
PD için başka bir hayvan modeli, LPS’nin dişeti dokusuna enjekte edilmesinden oluşur. Sonuç olarak, osteoklastogenez ve kemik kaybı uyarılır. Bu modelin histopatolojik özellikleri, daha yüksek proinflamatuar sitokinler, kollajen yıkımı ve alveoler kemik rezorpsiyonu 6,8 ile karakterize insan tarafından kurulan PD’ye benzer.
Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) enjeksiyonlarının tekniklerine dayanan deneysel PD’nin basit bir sıçan modelini ve ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına ligatür yerleştirilmesini tanımlamaktır. Bu, insan PD hastalığında gözlenenlere benzer özelliklere sahip, hastalık ilerleme mekanizmalarının ve gelecekteki olası tedavilerin incelenmesinde kullanılabilecek bir modeldir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, Pg-LPS enjeksiyonlarının kombine tekniğini ve M1 etrafındaki ligatür yerleşimini takiben sıçanlarda PD’nin indüksiyonunu açıklamakta ve periodontal dokularda ve alveoler kemikte önemli değişikliklerin bu yöntemi takip eden 14 gün içinde indüklenebileceğini ortaya koymaktadır.
Bu prosedür sırasında, farklı kritik adımlara dikkat edilmelidir. Hayvan anestezisi ve prosedür hazırlığı sırasında, cerrahi işlem sırasında uygun anestezinin değer…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Kavram kanıtı çağrısı 2020), ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (M.M.B. sözleşmesi; FI18/00104) ve Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear tarafından (M.M.F.C. sözleşmesi; FPI/040/2020). Yazarlar, deneysel cerrahi ve IdISBa platformundaki yardımları için Dr. Anna Tomás ve Maria Tortosa’ya teşekkür eder. Son olarak, CBCT tarayıcısına erişim için ADEMA Diş Hekimliği Fakültesi’ne teşekkürler.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referenzen
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
