عدوى الخلايا الظهارية الأنفية الأولية التي تنمو في واجهة الهواء السائل لتوصيف التفاعلات بين الإنسان والفيروس التاجي والمضيف
Summary
ظهارة الأنف هي موقع الحاجز الأساسي الذي تواجهه جميع مسببات الأمراض التنفسية. هنا ، نوضح طرق استخدام الخلايا الظهارية الأنفية الأولية التي تزرع كمزارع واجهة الهواء السائل (ALI) لتوصيف التفاعلات بين الإنسان ومضيف فيروس كورونا في نظام ذي صلة من الناحية الفسيولوجية.
Abstract
ظهرت ثلاثة فيروسات تاجية بشرية شديدة الإمراض (HCoVs) – SARS-CoV (2002) و MERS-CoV (2012) و SARS-CoV-2 (2019) – وتسببت في أزمات صحية عامة كبيرة في السنوات العشرين الماضية. تسبب أربعة فيروسات HCoVs إضافية جزءا كبيرا من حالات نزلات البرد الشائعة كل عام (HCoV-NL63 و -229E و -OC43 و -HKU1) ، مما يسلط الضوء على أهمية دراسة هذه الفيروسات في الأنظمة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تدخل HCoVs إلى الجهاز التنفسي وتثبت العدوى في ظهارة الأنف ، وهو الموقع الأساسي الذي تواجهه جميع مسببات الأمراض التنفسية. نحن نستخدم نظام الثقافة الظهارية الأنفية الأولية التي تزرع فيها عينات الأنف المشتقة من المريض في واجهة الهواء والسائل (ALI) لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض في هذا الموقع الحارس المهم. تلخص هذه الثقافات العديد من ميزات مجرى الهواء في الجسم الحي ، بما في ذلك أنواع الخلايا الموجودة ، والوظيفة الهدبية ، وإنتاج المخاط. نصف طرقا لتوصيف التكاثر الفيروسي ، وانتحاء الخلية المضيفة ، والسمية الخلوية التي يسببها الفيروس ، والحث المناعي الفطري في مزارع ALI الأنفية بعد عدوى HCoV ، باستخدام العمل الأخير الذي يقارن بين HCoVs المميت والموسمي كمثال1. إن الفهم المتزايد للتفاعلات بين المضيف والممرض في الأنف لديه القدرة على توفير أهداف جديدة للعلاجات المضادة للفيروسات ضد HCoVs وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى التي من المحتمل أن تظهر في المستقبل.
Introduction
تم تحديد سبعة فيروسات تاجية بشرية (HCoVs) حتى الآن وتسبب مجموعة من أمراض الجهاز التنفسي2. عادة ما ترتبط HCoVs الشائعة أو الموسمية (HCoV-NL63 و -229E و -OC43 و -HKU1) بأمراض الجهاز التنفسي العلوي وتسبب ما يقدر بنحو 10٪ -30٪ من حالات نزلات البرد سنويا. على الرغم من أن هذا هو النمط الظاهري السريري النموذجي المرتبط ب HCoVs الشائعة ، إلا أن هذه الفيروسات يمكن أن تسبب مرضا أكثر أهمية في الجهاز التنفسي السفلي لدى السكان المعرضين للخطر ، بما في ذلك الأطفال وكبار السن والأفراد الذين يعانون من نقص المناعة 3,4. ظهرت ثلاثة من فيروسات فيروس كورونا الممرض وتسببت في حالات طوارئ صحية عمومية كبيرة في السنوات ال 20 الماضية، بما في ذلك المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (سارس)، ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS)-CoV، وSARS-CoV-2. وترتبط فيروسات فيروس كورونا المفتاكة بأمراض الجهاز التنفسي الأكثر وخامة والتي يتضح بوضوح من معدل إماتة الحالات >34٪ المرتبط بحالات الإصابة بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (894 حالة وفاة من أكثر من 2500 حالة منذ ظهوره في عام 2012)5,6. من المهم ملاحظة أن فيروس التهاب الكبد الوبائي القاتل يسبب أيضا مجموعة من أمراض الجهاز التنفسي ، من الالتهابات عديمة الأعراض إلى الالتهاب الرئوي القاتل ، كما رأينا مع جائحة COVID-19 المستمرة7.
HCoVs ، مثل مسببات الأمراض التنفسية الأخرى ، تدخل الجهاز التنفسي وتؤسس عدوى منتجة في ظهارة الأنف8. يعتقد أن الانتشار إلى مجرى الهواء السفلي يرتبط بالشفط من تجويف الفم / الأنف إلى الرئة ، حيث تسبب HCoVs أمراضا أكثر أهمية في الجهاز التنفسي السفلي9،10،11. وبالتالي ، فإن الأنف بمثابة البوابة الأولية للدخول الفيروسي وهو الحاجز الأساسي للعدوى من خلال آلية إزالة الغشاء المخاطي الهدبي القوية وآليات المناعة الفطرية الفريدة التي تهدف إلى منع المزيد من انتشار الفيروس إلى مجرى الهواء السفلي12,13. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا الظهارية الأنفية تعبر عن مستويات قاعدية أعلى من المتوسط من الإنترفيرون المضاد للفيروسات والجينات المحفزة بالإنترفيرون ، مما يشير إلى أن الخلايا الأنفية قد تكون مهيأة للاستجابات المبكرة لفيروسات الجهاز التنفسي14،15،16.
لقد استخدمنا سابقا الخلايا الظهارية الأنفية الأولية المشتقة من المريض والتي نمت في واجهة الهواء السائل (ALI) لنمذجة تفاعلات مضيف HCoV في الأنف ، حيث تبدأ عدوى HCoV. تتساهل مزارع ALI الأنفية مع كل من مسببات الأمراض (SARS-CoV-2 و MERS-CoV) و HCoVs الشائعة (HCoV-NL63 و HCoV-229E) وتوفر مزايا مختلفة على خطوط الخلايا الظهارية في مجرى الهواء التقليدي مثل A549 (خط خلايا سرطان الرئة الغدي)16,17. بعد التمايز ، تحتوي مزارع ALI الأنفية على مجموعة خلوية غير متجانسة وتظهر العديد من الوظائف المتوقعة من ظهارة الأنف في الجسم الحي ، مثل آلية إزالة الغشاء المخاطيالهدبي 18. توفر الخلايا الأنفية أيضا مزايا على أنظمة زراعة مجرى الهواء السفلي (مثل الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية ، HBECs) ، حيث أن اكتساب الخلايا الظهارية الأنفية عن طريق تنظيف الخلايا بالفرشاة الخلوية أقل توغلا بشكل ملحوظ مقارنة باستخدام تقنيات مثل تنظير القصبات لتحقيق HBECs19،20،21.
تصف هذه الورقة طرق استخدام نظام زراعة ALI الأنفي هذا لتوصيف تفاعلات مضيف HCoV في ظهارة الأنف. لقد طبقنا هذه الأساليب في الأعمال المنشورة مؤخرا لمقارنة SARS-CoV-2 و MERS-CoV و HCoV-NL63 و HCoV-229E1،16،17. على الرغم من أن هذه الطرق والنتائج التمثيلية تؤكد على دراسة HCoVs في نموذج الخلايا الأنفية هذا ، إلا أن النظام قابل للتكيف بشكل كبير مع HCoVs الأخرى ، بالإضافة إلى مسببات الأمراض التنفسية الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطرق على نطاق أوسع على أنظمة زراعة ALI الأخرى من أجل التحقيق في التكاثر الفيروسي والانتحاء الخلوي ، وكذلك السمية الخلوية والحث المناعي الفطري بعد العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الطرق المفصلة هنا نظام الثقافة الظهارية الأولية التي تزرع فيها الخلايا الظهارية الأنفية المشتقة من المريض في واجهة الهواء السائل وتطبيقها على دراسة تفاعلات HCoV-host. بمجرد التمايز ، تلخص ثقافات ALI الأنفية هذه العديد من ميزات ظهارة الأنف في الجسم الحي ، بما في ذلك مجموعة خلوية غير مت?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تحتوي هذه الدراسة على مصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. و N.A.C.) ، NIH R01AI 140442 (SRW) ، VA Merit Review CX001717 (N.A.C.) ، VA Merit Review BX005432 (S.R.W. و N.A.C.) ، مركز بن لأبحاث الفيروسات التاجية ومسببات الأمراض الناشئة الأخرى (SRW) ، مؤسسة Laffey-McHugh (SRW و N.A.C.) ، T32 AI055400 (CJO) ، T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
Referenzen
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
