Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano
Summary
El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.
Abstract
En los últimos 20 años han surgido tres coronavirus humanos altamente patógenos —el SARS-CoV (2002), el MERS-CoV (2012) y el SARS-CoV-2 (2019)— que han causado importantes crisis de salud pública. Cuatro HCoV adicionales causan una parte significativa de los casos de resfriado común cada año (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1), lo que destaca la importancia de estudiar estos virus en sistemas fisiológicamente relevantes. Los HCoV ingresan al tracto respiratorio y establecen la infección en el epitelio nasal, el sitio principal que encuentran todos los patógenos respiratorios. Utilizamos un sistema de cultivo epitelial nasal primario en el que las muestras nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar las interacciones huésped-patógeno en este importante sitio centinela. Estos cultivos recapitulan muchas características de la vía aérea in vivo , incluidos los tipos de células presentes, la función ciliar y la producción de moco. Describimos métodos para caracterizar la replicación viral, el tropismo de la célula huésped, la citotoxicidad inducida por virus y la inducción inmune innata en cultivos nasales de ALI después de la infección por HCoV, utilizando como ejemplo trabajos recientes que comparan HCoV letales y estacionales1. Una mayor comprensión de las interacciones huésped-patógeno en la nariz tiene el potencial de proporcionar nuevos objetivos para la terapéutica antiviral contra los HCoV y otros virus respiratorios que probablemente surjan en el futuro.
Introduction
Hasta la fecha se han identificado siete coronavirus humanos (HCoV) que causan una serie de enfermedades respiratorias2. Los HCoV comunes o estacionales (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1) generalmente se asocian con patología del tracto respiratorio superior y causan aproximadamente entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común anualmente. Aunque este es el fenotipo clínico típico asociado con los HCoV comunes, estos virus pueden causar una enfermedad más significativa del tracto respiratorio inferior en poblaciones de riesgo, incluidos niños, adultos mayores e inmunodeprimidos 3,4. En los últimos 20 años han surgido tres HCoV patógenos que han causado importantes emergencias de salud pública, entre ellos el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV y el SARS-CoV-2. Los HCoV letales se asocian con una patología más grave de las vías respiratorias, lo que queda claramente ilustrado por la tasa de letalidad del >34% asociada a los casos de MERS-CoV (894 muertes en más de 2.500 casos desde su aparición en 2012)5,6. Es importante tener en cuenta que los HCoV letales también causan una serie de enfermedades de las vías respiratorias, desde infecciones asintomáticas hasta neumonía letal, como se ha visto con la actual pandemia de COVID-197.
Los HCoV, al igual que otros patógenos respiratorios, entran en el tracto respiratorio y establecen una infección productiva en el epitelio nasal8. Se cree que la diseminación a la vía aérea inferior está asociada con la aspiración desde la cavidad oral/nasal hasta el pulmón, donde los HCoV causan una patología más significativa del tracto respiratorio inferior 9,10,11. Por lo tanto, la nariz sirve como el portal inicial para la entrada viral y es la principal barrera para la infección con su robusta maquinaria de eliminación mucociliar y mecanismos inmunológicos innatos únicos destinados a prevenir una mayor propagación viral a las vías respiratorias inferiores12,13. Por ejemplo, se ha reportado que las células epiteliales nasales expresan niveles basales más altos que el promedio de interferones antivirales y genes estimulados por interferón, lo que indica que las células nasales pueden estar preparadas para respuestas tempranas a virus respiratorios14,15,16.
Anteriormente hemos utilizado células epiteliales nasales primarias derivadas de pacientes cultivadas en una interfaz aire-líquido (ALI) para modelar las interacciones entre el HCoV y el huésped en la nariz, donde comienzan las infecciones por HCoV. Los cultivos nasales de ALI son permisivos tanto para los HCoV patógenos (SARS-CoV-2 y MERS-CoV) como para los comunes (HCoV-NL63 y HCoV-229E) y ofrecen varias ventajas sobre las líneas celulares epiteliales tradicionales de las vías respiratorias, como A549 (una línea celular de adenocarcinoma de pulmón)16,17. Después de la diferenciación, los cultivos nasales de ALI contienen una población celular heterogénea y exhiben muchas de las funciones esperadas del epitelio nasal in vivo, como la maquinaria de depuración mucociliar18. Las células nasales también ofrecen ventajas sobre los sistemas de cultivo de la vía aérea inferior (como las células epiteliales bronquiales humanas, HBEC), ya que la adquisición de células epiteliales nasales a través del cepillado citológico es significativamente menos invasiva en comparación con el uso de técnicas como la broncoscopia para la obtención de HBEC 19,20,21.
En este artículo se describen los métodos para utilizar este sistema de cultivo nasal de ALI para caracterizar las interacciones HCoV-huésped en el epitelio nasal. Hemos aplicado estos métodos en trabajos publicados recientemente para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E 1,16,17. Aunque estos métodos y resultados representativos enfatizan el estudio de los HCoV en este modelo de células nasales, el sistema es altamente adaptable a otros HCoV, así como a otros patógenos respiratorios. Además, estos métodos pueden aplicarse de forma más amplia a otros sistemas de cultivo de ALI para investigar la replicación viral y el tropismo celular, así como la citotoxicidad y la inducción inmunitaria innata tras la infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos que se detallan aquí describen un sistema de cultivo epitelial primario en el que las células epiteliales nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido y se aplican al estudio de las interacciones HCoV-huésped. Una vez diferenciados, estos cultivos nasales de ALI recapitulan muchas características del epitelio nasal in vivo , incluida una población celular heterogénea con células ciliadas, caliciformes y basales representadas, así como una función mucociliar intac…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio cuenta con las siguientes fuentes de financiamiento: Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01AI 169537 (S.R.W. y N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. y N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. y N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
Referenzen
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