Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano
Summary
O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.
Abstract
Três coronavírus humanos altamente patogênicos (HCoVs) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) – emergiram e causaram crises de saúde pública significativas nos últimos 20 anos. Quatro HCoVs adicionais causam uma parcela significativa de casos de resfriado comum a cada ano (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), destacando a importância do estudo desses vírus em sistemas fisiologicamente relevantes. Os HCoVs entram no trato respiratório e estabelecem a infecção no epitélio nasal, o sítio primário encontrado por todos os patógenos respiratórios. Usamos um sistema primário de cultura epitelial nasal no qual amostras nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido (LPA) para estudar as interações patógeno-hospedeiro neste importante sítio sentinela. Essas culturas recapitulam muitas características da via aérea in vivo , incluindo os tipos celulares presentes, a função ciliar e a produção de muco. Descrevemos métodos para caracterizar a replicação viral, o tropismo de células hospedeiras, a citotoxicidade induzida por vírus e a indução de imune inata em culturas nasais de LPA após infecção por HCoV, usando trabalhos recentes comparando HCoVs letal e sazonal como exemplo1. Uma maior compreensão das interações hospedeiro-patógeno no nariz tem o potencial de fornecer novos alvos para a terapêutica antiviral contra HCoVs e outros vírus respiratórios que provavelmente surgirão no futuro.
Introduction
Sete coronavírus humanos (HCoVs) foram identificados até o momento e causam uma série de doenças respiratórias2. Os HCoVs comuns ou sazonais (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) são tipicamente associados à patologia do trato respiratório superior e causam cerca de 10%-30% dos casos de resfriado comum anualmente. Embora esse seja o fenótipo clínico típico associado ao HCoVs, esses vírus podem causar doença mais significativa do trato respiratório inferior em populações de risco, incluindo crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos 3,4. Três HCoVs patogênicos surgiram e causaram emergências de saúde pública significativas nos últimos 20 anos, incluindo síndrome respiratória aguda grave (SARS)-CoV, síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Os HCoVs letais estão associados a patologias mais graves do trato respiratório, o que é claramente ilustrado pela taxa de letalidade de >34% associada aos casos de MERS-CoV (894 mortes em mais de 2.500 casos desde seu surgimento em 2012)5,6. É importante notar que os HCoVs letais também causam uma série de doenças do trato respiratório, desde infecções assintomáticas até pneumonia letal, como visto com a pandemia COVID-19 em curso7.
Os HCoVs, como outros patógenos respiratórios, entram no trato respiratório e estabelecem uma infecção produtiva no epitélionasal8. Acredita-se que a disseminação para a via aérea inferior esteja associada à aspiração da cavidade oral/nasal para o pulmão, onde os HCoVs causam patologia mais significativa do trato respiratório inferior9,10,11. Assim, o nariz serve como o portal inicial para a entrada viral e é a barreira primária à infecção com sua robusta maquinaria de depuração mucociliar e mecanismos imunes inatos únicos destinados a prevenir a disseminação viral para as vias aéreasinferiores12,13. Por exemplo, foi relatado que células epiteliais nasais expressam níveis basais acima da média de interferons antivirais e genes estimulados por interferon, indicando que as células nasais podem ser preparadas para respostas precoces a vírus respiratórios14,15,16.
Utilizamos previamente células epiteliais nasais primárias derivadas do paciente cultivadas em uma interface ar-líquido (LPA) para modelar as interações HCoV-hospedeiro no nariz, onde as infecções por HCoV começam. As culturas nasais de LPA são permissivas tanto para HCoVs patogênicos (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) quanto para HCoVs comuns (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e oferecem várias vantagens sobre linhagens celulares epiteliais tradicionais das vias aéreas, como a A549 (uma linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar)16,17. Após a diferenciação, as culturas nasais de LPA contêm uma população celular heterogênea e exibem muitas das funções esperadas do epitélio nasal in vivo, como a maquinaria de depuração mucociliar18. As células nasais também oferecem vantagens sobre os sistemas de cultura das vias aéreas inferiores (como as células epiteliais brônquicas humanas, HBECs), uma vez que a aquisição de células epiteliais nasais via escovação citológica é significativamente menos invasiva em comparação com o uso de técnicas como a broncoscopia para a obtenção de HBECs 19,20,21.
Este trabalho descreve métodos de utilização deste sistema de cultura de LPA nasal para caracterizar as interações HCoV-hospedeiro no epitélio nasal. Nós aplicamos estes métodos em trabalhos recentemente publicados para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63, e HCoV-229E 1,16,17. Embora esses métodos e resultados representativos enfatizem o estudo dos HCoVs neste modelo de células nasais, o sistema é altamente adaptável a outros HCoVs, bem como a outros patógenos respiratórios. Além disso, esses métodos podem ser aplicados de forma mais ampla a outros sistemas de cultura de LPA, a fim de investigar a replicação viral e o tropismo celular, bem como a citotoxicidade e a indução imune inata após a infecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui detalhados descrevem um sistema primário de cultura epitelial no qual células epiteliais nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido e aplicadas ao estudo das interações HCoV-hospedeiro. Uma vez diferenciadas, essas culturas nasais de LPA recapitulam muitas características do epitélio nasal in vivo , incluindo uma população celular heterogênea com células ciliadas, caliciformes e basais representadas, bem como função mucociliar intacta com cílios e secr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo tem as seguintes fontes de financiamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
Referenzen
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