Celvrije DNA-extractie van glasvocht en kamerwatermonsters voor diagnose en monitoring van vitreoretinaal lymfoom
Summary
Een procedure om celvrij DNA uit glasvocht en kamerwater te extraheren om moleculaire studies uit te voeren voor het diagnosticeren van vitreoretinaal lymfoom is hier vastgesteld. De methode biedt de mogelijkheid om tegelijkertijd DNA uit de cellulaire component van het monster te extraheren of te reserveren voor aanvullend onderzoek.
Abstract
Vitreoretinaal lymfoom (VRL) vertegenwoordigt een agressief lymfoom, vaak gecategoriseerd als primair diffuus grootcellig B-cellymfoom van het centrale zenuwstelsel. Om VRL te diagnosticeren, worden specimens zoals glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater verzameld. Diagnostische tests voor VRL op deze monsters omvatten cytologie, flowcytometrie en moleculair testen. Zowel cytopathologie als flowcytometrie, samen met moleculaire tests met behulp van cellulair DNA, vereisen echter intacte hele cellen. De uitdaging ligt in het feit dat glasvocht en kamerwater doorgaans een lage cellulariteit hebben en dat veel cellen worden vernietigd tijdens het verzamelen, opslaan en verwerken. Bovendien vormen deze monsters extra problemen voor moleculaire tests vanwege de hoge viscositeit van glasvocht en het lage volume van zowel glasvocht als kamerwater. Deze studie stelt een methode voor om celvrij DNA te extraheren uit glasachtig en waterig monsters. Deze benadering vormt een aanvulling op de extractie van cellulair DNA of maakt het mogelijk de cellulaire component van deze monsters te gebruiken voor andere diagnostische methoden, waaronder cytologie en flowcytometrie.
Introduction
Vitreoretinaal lymfoom (VRL) is een agressief lymfoom geassocieerd met primair diffuus grootcellig B-cellymfoomvan het centrale zenuwstelsel 1,2,3. VRL is meestal dodelijk vanwege de betrokkenheid ervan bij het centrale zenuwstelsel 1,2. Hoewel zeldzaam1,4, presenteert VRL zich vaak met symptomen die lijken op posterieure uveïtis en andere vitreoretinale aandoeningen 4,5. Bijgevolg hebben patiënten met uveïtissymptomen een diagnose nodig om VRL te bevestigen of uit te sluiten.
Onlangs zijn consensuscriteria voor het diagnosticeren van VRL gepubliceerd, die een combinatie van klinisch onderzoek en laboratoriumbevindingenomvatten6. Specimens die vaak worden gebruikt om VRL te diagnosticeren, zijn onder meer glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater7. Glasvocht wordt verkregen door middel van een chirurgische ingreep genaamd pars plana vitrectomie, die toegang geeft tot het achterste segment van het oog8.
In het gepresenteerde protocol werden zowel kamerwater als glasvochtmonsters verzameld voor cellulaire en cfDNA-extractie. Na het verdoven van de patiënten en het plaatsen van trocars op ongeveer 4 mm van de cornea-limbus, werd een kamerwatermonster van ongeveer 100-200 μL verkregen met behulp van een tuberculinespuit van 1 ml in de cornea-limbus. Bij pseudofakische patiënten werd onverdund glasvocht verkregen door steriele lucht in de infusie te brengen, waardoor een grotere hoeveelheid onverdund glasvocht (tot 3,5 ml) kon worden verzameld. Bij fakische patiënten werd ongeveer 500 tot 1000 μl onverdund glasvocht verwijderd voordat een infusie met een uitgebalanceerde zoutoplossing werd ingeschakeld. In sommige gevallen werd secundair verdund glasvocht (500 tot 2.000 μL) verzameld door de infusie over te schakelen op vloeistof en de vitrector in de glasvochtrok te plaatsen om dit monster te verkrijgen. De meest verdunde glasvochtfractie werd verzameld door de cassettezak te bewaren (aanvullende figuur 1) aan het einde van de operatie. Zodra deze zak de afdeling pathologie bereikte, werd verdund glasvocht verkregen door vloeistof uit deze zak in conische buizen af te tappen voor daaropvolgende DNA-extractie.
Cytopathologie van glasvocht wordt vaak beschouwd als de gouden standaard9. Verschillende onderzoeken hebben echter een beperkte gevoeligheid aangetoond als gevolg van verwerking en minimale cellulariteit10,11,12. Flowcytometrie kan helpen bij het identificeren van klonale B-cellen, maar kan ook worden beperkt door een lage cellulariteit en de kwetsbaarheid van grote lymfoomcellen13,14,15. Zowel cytopathologie als flowcytometrie vereisen intacte hele cellen. Veel van deze cellen worden vernietigd tijdens het verzamelen, opslaan en verwerken. Wanneer moleculair testen wordt uitgevoerd met behulp van DNA dat is geëxtraheerd uit intacte cellen (cellulair DNA), lijdt het aan dezelfde beperking. Bovendien vermindert het verdelen van het beperkte glasvochtmonster voor al deze tests de hoeveelheid materiaal die voor elke test beschikbaar is.
Celvrij DNA (cfDNA) vertegenwoordigt een andere bron van DNA waarvoor geen intacte cellen nodig zijn. cfDNA van glasvochtmonsters is gebruikt voor de detectie van VRL 16,17 en oogmelanoom18. In dit protocol wordt cellulair en celvrij DNA geëxtraheerd uit glasvocht en waterige vloeistof om VRL te detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitreoretinaal lymfoom (VRL) is een agressief grootcellig B-cellymfoom 1,2,3 waarvan de symptomen andere vitreoretinale aandoeningen kunnen nabootsen 4,5. Moleculair testen van glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater is een kritische methode geworden om de diagnose VRL te stellen of uit te sluiten. Deze vloeistoffen hebben echter een zeer laag volume en hebben vaak ee…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS en Helmut Weigelin, MLS (ASCP) speelden een belangrijke rol bij het opzetten van deze extractiemethode in ons laboratorium.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Referenzen
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
