網膜硝子体リンパ腫の診断とモニタリングのための硝子体および房水検体の無細胞DNA抽出
Summary
ここでは、網膜硝子体リンパ腫を診断するための分子研究を行うために、硝子体および房水から無細胞DNAを抽出する手順が確立されています。この方法では、サンプルの細胞成分からDNAを同時に抽出したり、補助的な検査のためにDNAを予約したりできます。
Abstract
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は侵攻性リンパ腫であり、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫に分類されることが多い。VRLを診断するために、硝子体液や最近では房水などの標本が収集されます。これらの検体に対するVRLの診断検査には、細胞診、フローサイトメトリー、および分子検査が含まれます。しかし、細胞病理学とフローサイトメトリーはどちらも、細胞DNAを用いた分子検査とともに、無傷の全細胞を必要とします。課題は、硝子体および房水は通常細胞性が低く、多くの細胞が収集、保管、および処理中に破壊されるという事実にあります。さらに、これらの標本は、硝子体液の粘度が高く、硝子体液と房水の両方の量が少ないため、分子検査にさらなる困難をもたらします。本研究では、ガラス質および水性試料から無細胞DNAを抽出する方法を提案します。このアプローチは、細胞DNAの抽出を補完したり、これらの標本の細胞成分を細胞診やフローサイトメトリーなどの他の診断方法に利用したりすることができます。
Introduction
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、原発性中枢神経系びまん性大細胞型B細胞リンパ腫1,2,3に関連する侵攻性リンパ腫です。VRLは、中枢神経系への関与により、典型的には致命的である1,2。まれではあるが1,4、VRLはしばしば後部ぶどう膜炎や他の網膜硝子体疾患に似た症状を呈する4,5。その結果、ぶどう膜炎の症状を示す患者は、VRLを確認または除外するための診断を必要とします。
最近、VRLを診断するためのコンセンサス基準が発表されましたが、これには臨床検査と検査所見の組み合わせが含まれます6。VRLの診断に一般的に使用される標本には、硝子体液、そして最近では房水が含まれます7。硝子体液は、扁平部硝子体切除術と呼ばれる外科的処置によって得られ、これにより眼の後部セグメントへのアクセスが可能になります8。
提示されたプロトコルでは、房水と硝子体液の両方の標本が細胞およびcfDNA抽出のために収集されました。患者に麻酔をかけ、角膜辺縁から約4 mmのところにトロカールを配置した後、角膜辺縁部に1 mLのツベルクリン注射器を使用して、約100〜200μLの房水サンプルが得られました。偽水晶体患者の場合、未希釈硝子体は無菌空気を注入液に導入することによって得られ、より多くの未希釈硝子体(最大3.5 mL)の収集が可能になりました。.有水晶体患者では、平衡塩溶液の注入をオンにする前に、約500〜1000μLの希釈されていない硝子体が除去されました。.場合によっては、注入液を液体に切り替え、硝子体スカート内に硝子体を配置してこのサンプルを得ることにより、二次希釈された硝子体(500〜2,000μL)を採取しました。最も希薄な硝子体画分は、手術終了時にカセットバッグ(補足図1)を保存することによって収集されました。このバッグが病理部門に到着すると、このバッグから液体を円錐形のチューブに排出して希薄な硝子体が得られ、その後のDNA抽出が行われました。
硝子体液の細胞病理学は、しばしばゴールドスタンダードと見なされます9。しかし、いくつかの研究では、処理と細胞性が最小限であるため、感度が限られていることが示されています10,11,12。フローサイトメトリーは、クローン性B細胞の同定に役立ちますが、細胞性が低く、大きなリンパ腫細胞の脆弱性によって制限されることもあります13,14,15。細胞病理学とフローサイトメトリーの両方に、無傷の全細胞が必要です。これらの細胞の多くは、収集、保管、および処理中に破壊されます。無傷の細胞(細胞DNA)から抽出したDNA(細胞DNA)を用いて分子検査を行う場合も、これと同じ制限があります。さらに、これらすべての試験で限られた硝子体標本を分割すると、各試験に利用できる材料の量が減少します。
無細胞DNA(cfDNA)は、無傷の細胞を必要としないDNAの別の供給源です。硝子体標本由来のcfDNAは、VRL 16,17およびブドウ膜黒色腫18の検出に使用されています。このプロトコルでは、細胞および無細胞DNAを硝子体および水性流体から抽出してVRLを検出します。
Protocol
Representative Results
Discussion
網膜硝子体リンパ腫(VRL)は、侵攻性の大細胞型B細胞リンパ腫であり1,2,3、その症状は他の網膜硝子体疾患を模倣する可能性があります4,5。硝子体、そして最近では房水の分子検査は、VRLの診断を下すか、または除外するための重要な方法になっています。ただし、これらの液体?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, および Helmut Weigelin, MLS(ASCP) は、この抽出法を研究室内で確立するのに尽力しました。
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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