Optimisation de la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin de souris : un guide complet de la trypsinisation
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole vidéo détaillé pour la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin (LEC), visant à améliorer la reproductibilité et à faciliter la recherche sur la cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (PCO). Il offre des instructions étape par étape sur la dissection du cristallin, l’isolation et la validation des LEC, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux arrivants dans le domaine.
Abstract
Les cellules épithéliales du cristallin (LEC) jouent de multiples rôles importants dans le maintien de l’homéostasie et de la fonction normale du cristallin. Les LEC déterminent la croissance, le développement, la taille et la transparence des lentilles. À l’inverse, un CLE dysfonctionnel peut entraîner la formation de cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (OCP). Par conséquent, la mise en place d’un système de culture primaire LEC robuste est importante pour les chercheurs engagés dans le développement de lentilles, la biochimie, les traitements de la cataracte et la prévention du SOPK. Cependant, la culture des LEC primaires a longtemps présenté des défis en raison de leur disponibilité limitée, de leur faible taux de prolifération et de leur nature délicate.
Cette étude aborde ces obstacles en présentant un protocole complet pour la culture primaire des LEC. Le protocole comprend des étapes essentielles telles que la formulation d’un milieu de culture optimisé, l’isolement précis des capsules de lentilles, les techniques de trypsinisation, les procédures de sous-culture, les protocoles de récolte et les directives pour le stockage et l’expédition. Tout au long du processus de culture, la morphologie cellulaire a été surveillée à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
Pour confirmer l’authenticité des LEC en culture, des tests d’immunofluorescence ont été effectués pour détecter la présence et la distribution subcellulaire de protéines critiques du cristallin, à savoir les αA- et γ-cristallins. Ce protocole détaillé fournit aux chercheurs une ressource précieuse pour cultiver et caractériser les LEC primaires, permettant des progrès dans notre compréhension de la biologie du cristallin et le développement de stratégies thérapeutiques pour les troubles liés au cristallin.
Introduction
Le cristallin de l’œil joue un rôle crucial dans la vision en concentrant la lumière entrante sur la rétine. Il s’agit d’une structure avasculaire transparente composée de cellules spécialisées, parmi lesquelles les cellules épithéliales du cristallin (LEC) sont des acteurs clés. Les LEC sont situés sur la surface antérieure du cristallin et sont responsables du maintien de sa transparence, de la régulation de l’équilibre hydrique et de la participation à la croissance et au développement du cristallin 1,2. Les LEC sont un type unique de cellules situées dans la partie antérieure du cristallin, jouant un rôle essentiel dans le maintien de la clarté et de la fonction du cristallin en produisant continuellement des fibres du cristallin tout au long de la vie.
La cataracte se caractérise par l’opacification progressive du cristallin, entraînant la distorsion et la diffusion de la lumière, ce qui compromet la vision 3,4. Les mécanismes précis sous-jacents à la formation de la cataracte sont complexes et multifactoriels, impliquant divers processus cellulaires et moléculaires tels que les rayons UV, les dommages oxydatifs et la glycation 5,6. Il a été constaté que les LEC contribuent de manière significative au développement de la cataracte, ce qui en fait un axe essentiel de recherche 1,2,7,8,9.
De plus, l’un des problèmes les plus urgents en ophtalmologie aujourd’hui est l’incidence relativement élevée de l’opacification de la capsule postérieure (OCP), également connue sous le nom de cataracte secondaire. Le SOPK reste la complication la plus fréquente après une chirurgie de la cataracte, touchant jusqu’à 20 à 40 % des patients adultes et 100 % des enfants dans les 5 ans suivant la chirurgie10. L’OCP est principalement causée par les LEC résiduels qui restent dans le sac capsulaire après l’extraction de la cataracte. Ces cellules subissent une transformation physiopathologique à multiples facettes impliquant non seulement la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), mais aussi la différenciation des LEC en fibres du cristallin, ce qui donne une population cellulaire qui est un mélange de LEC, de fibres et de myofibroblastes 11,12,13. Les cellules transformées prolifèrent et migrent à travers la capsule postérieure du cristallin, entraînant une déficience visuelle. Comprendre le comportement et les mécanismes de contrôle des LEC dans les modèles de culture peut fournir des informations précieuses sur la prévention et la gestion du PCO. Par conséquent, ce protocole de culture des LEC constitue un outil essentiel pour les chercheurs en ophtalmologie visant à étudier, comprendre et, en fin de compte, combattre cette complication postopératoire répandue.
Pour démêler les subtilités de la biologie du LEC et son rôle dans la formation de la cataracte et du PCO, il est essentiel d’établir des systèmes de culture cellulaire primaire in vitro robustes et reproductibles. La culture primaire de LEC fournit aux chercheurs un environnement contrôlé pour étudier les fonctions, la signalisation et les caractéristiques moléculaires des LEC. En outre, il permet d’étudier les processus cellulaires et les effets de différentes conditions expérimentales, fournissant des informations précieuses sur la physiologie et la pathologie du cristallin.
Des recherches antérieures ont enrichi notre compréhension des techniques de culture LEC 14,15,16,17,18,19,20. Bien que ces études aient utilisé diverses méthodologies et donné des résultats significatifs sur le comportement et les caractéristiques des LEC, il n’existe pas de protocole d’enregistrement vidéo complet et accessible pour la culture des LEC dans la littérature actuelle. Cette limitation peut entraver la capacité des chercheurs novices à reproduire fidèlement les techniques et peut entraîner des incohérences et des variations dans les résultats expérimentaux. En fournissant un protocole d’enregistrement vidéo, ce document de recherche vise à combler cette lacune et à fournir une ressource standardisée qui peut améliorer la reproductibilité et faciliter le transfert de connaissances dans le domaine de la culture LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté dans ce document fournit un guide complet, étape par étape, pour réussir l’isolement, la culture et la sous-culture des ESL primaires, accompagné d’une documentation vidéo. Le guide visuel détaillé ainsi que les instructions écrites améliorent la clarté et l’accessibilité du protocole, favorisant son utilisation et sa reproductibilité auprès des chercheurs dans le domaine. L’objectif ultime est de contribuer à l’ensemble croissant des connaissances entourant le rôle des LE…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NEI R21EY033941 (à Hongli Wu) ; le ministère de la Défense W81XWH2010896 (à Hongli Wu) ; R15GM123463-02 (à Kayla Green et Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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