Fare Primer Lens Epitel Hücre Kültürünü Optimize Etme: Tripsinizasyon için Kapsamlı Bir Kılavuz
Summary
Bu makale, katarakt ve arka kapsül opaklaşmasında (PCO) tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi ve araştırmalara yardımcı olmayı amaçlayan primer lens epitel hücrelerinin (LEC’ler) kültürlenmesi için ayrıntılı bir video protokolünü özetlemektedir. Lens diseksiyonu, LEC izolasyonu ve validasyonu hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle bu alanda yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.
Abstract
Lens epitel hücreleri (LEC’ler), lensin homeostazını ve normal fonksiyonunu korumada birçok önemli rol oynar. LEC’ler lens büyümesini, gelişimini, boyutunu ve şeffaflığını belirler. Tersine, işlevsiz LEC’ler katarakt oluşumuna ve arka kapsül opaklaşmasına (PCO) yol açabilir. Sonuç olarak, sağlam bir birincil LEC kültür sistemi oluşturmak, lens geliştirme, biyokimya, katarakt terapötikleri ve PCO önleme ile uğraşan araştırmacılar için önemlidir. Bununla birlikte, birincil LEC’lerin yetiştirilmesi, sınırlı kullanılabilirlikleri, yavaş çoğalma oranları ve hassas yapıları nedeniyle uzun süredir zorluklar ortaya çıkarmaktadır.
Bu çalışma, birincil LEC kültürü için kapsamlı bir protokol sunarak bu engelleri ele almaktadır. Protokol, optimize edilmiş bir kültür ortamının formülasyonu, lens kapsüllerinin hassas izolasyonu, tripsinizasyon teknikleri, alt kültür prosedürleri, hasat protokolleri ve depolama ve sevkiyat kılavuzları gibi temel adımları kapsar. Kültür işlemi boyunca, hücre morfolojisi faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi.
Kültürlenmiş LEC’lerin gerçekliğini doğrulamak için, kritik lens proteinlerinin, yani αA- ve γ-kristalinlerin varlığını ve hücre altı dağılımını tespit etmek için immünofloresan testleri yapılmıştır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıları birincil LEC’leri geliştirmek ve karakterize etmek için değerli bir kaynakla donatarak, lens biyolojisini anlamamızda ve lensle ilgili bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesinde ilerlemeler sağlar.
Introduction
Göz merceği, gelen ışığı retinaya odaklayarak görmede çok önemli bir rol oynar. Lens epitel hücrelerinin (LEC’ler) anahtar oyuncular olduğu özel hücrelerden oluşan şeffaf, avasküler bir yapıdan oluşur. LEC’ler lensin ön yüzeyinde bulunur ve şeffaflığını korumaktan, su dengesini düzenlemekten ve lens büyümesine ve gelişimine katılmaktansorumludur 1,2. LEC’ler, lensin ön kısmında bulunan benzersiz bir hücre türüdür ve yaşam boyunca sürekli olarak lens lifleri üreterek lens netliğini ve işlevini korumada kritik bir rol oynar.
Katarakt, merceğin ilerleyici bulanıklaşması ile karakterizedir, bu da ışığın bozulmasına ve saçılmasına neden olarak görme bozukluğuna yol açar 3,4. Katarakt oluşumunun altında yatan kesin mekanizmalar, UV radyasyonu, oksidatif hasar ve glikasyon gibi çeşitli hücresel ve moleküler süreçleri içeren karmaşık ve çok faktörlüdür 5,6. LEC’lerin katarakt gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğu bulunmuştur ve bu da onları araştırmaların hayati bir odak noktası haline getirmiştir 1,2,7,8,9.
Ayrıca, günümüzde oftalmolojideki en acil konulardan biri, sekonder katarakt olarak da bilinen posterior kapsül opaklaşmasının (PCO) nispeten yüksek insidansıdır. PKO, katarakt ameliyatından sonra en sık görülen komplikasyon olmaya devam etmekte olup, ameliyattan sonraki 5 yıl içinde yetişkin hastaların %20-40’ını ve çocukların %100’ünü etkilemektedir10. PCO’ya öncelikle katarakt ekstraksiyonunu takiben kapsül torbasında kalan rezidüel LEC’ler neden olur. Bu hücreler, sadece epitelden mezenkimal geçişe (EMT) değil, aynı zamanda LEC’lerin lens liflerine farklılaşmasını da içeren çok yönlü bir patofizyolojik dönüşüme uğrar, bu da LEC’lerin, liflerin ve miyofibroblastların bir karışımı olan bir hücre popülasyonu ile sonuçlanır 11,12,13. Dönüştürülen hücreler çoğalır ve arka lens kapsülü boyunca göç ederek görme bozukluğuna yol açar. Kültür modellerinde LEC’lerin davranış ve kontrol mekanizmalarını anlamak, PKO’nun önlenmesi ve yönetimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, LEC’lerin kültürlenmesine yönelik bu protokol, bu yaygın postoperatif komplikasyonu incelemeyi, anlamayı ve nihayetinde bunlarla mücadele etmeyi amaçlayan oftalmik araştırmacılar için hayati bir araç sunmaktadır.
LEC biyolojisinin inceliklerini ve katarakt oluşumu ve PCO’daki rolünü çözmek için sağlam ve tekrarlanabilir in vitro primer hücre kültürü sistemleri kurmak esastır. Birincil LEC kültürü, araştırmacılara LEC’lerin işlevlerini, sinyalizasyonunu ve moleküler özelliklerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar. Ayrıca, hücresel süreçlerin ve farklı deneysel koşulların etkilerinin araştırılmasına olanak tanıyarak lens fizyolojisi ve patolojisi hakkında değerli bilgiler sağlar.
Önceki araştırmalar, LEC kültür teknikleri 14,15,16,17,18,19,20 hakkındaki anlayışımızı zenginleştirdi. Bu çalışmalar çeşitli metodolojiler kullanmış ve LEC davranışı ve özellikleri hakkında önemli bulgular vermiş olsa da, mevcut literatürde LEC’leri kültürlemek için kapsamlı ve erişilebilir bir video kayıt protokolü yoktur. Bu sınırlama, acemi araştırmacıların teknikleri doğru bir şekilde yeniden üretme yeteneğini engelleyebilir ve deneysel sonuçlarda tutarsızlıklara ve farklılıklara yol açabilir. Bu araştırma makalesi, bir video kayıt protokolü sağlayarak bu boşluğu doldurmayı ve LEC kültürü alanında tekrarlanabilirliği artırabilecek ve bilgi aktarımını kolaylaştırabilecek standartlaştırılmış bir kaynak sağlamayı amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu belgede sunulan protokol, birincil LEC’lerin başarılı izolasyonu, kültürü ve alt kültürü için kapsamlı, adım adım bir kılavuz ve beraberindeki video belgeleriyle birlikte sunulmaktadır. Yazılı talimatların yanı sıra ayrıntılı görsel kılavuz, protokolün netliğini ve erişilebilirliğini artırarak alandaki araştırmacılar arasında kullanımını ve tekrarlanabilirliğini teşvik eder. Nihai amaç, katarakt cerrahisini takiben yaygın bir komplikasyon olan katarakt oluşumu ve PCO’da LEC’le…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NEI R21EY033941 (Hongli Wu’ya) tarafından desteklendi; Savunma Bakanlığı W81XWH2010896 (Hongli Wu’ya); R15GM123463-02 (Kayla Green ve Hongli Wu’ya)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
Referenzen
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Entwicklungsbiologie. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
