マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド
Summary
この原稿では、初代水晶体上皮細胞(LEC)を培養するための詳細なビデオプロトコルの概要を説明し、白内障および後嚢混濁(PCO)の再現性を向上させ、研究を支援することを目的としています。レンズの解剖、LECの分離、バリデーションに関するステップバイステップの説明を提供し、特にこの分野の初心者にとって貴重なガイドとなります。
Abstract
水晶体上皮細胞(LEC)は、水晶体の恒常性と正常な機能を維持する上で複数の重要な役割を果たします。LECは、レンズの成長、発育、サイズ、透明度を決定します。逆に、機能不全のLECは、白内障の形成と後嚢混濁(PCO)につながる可能性があります。したがって、堅牢な一次LEC培養システムを確立することは、レンズ開発、生化学、白内障治療、PCO予防に従事する研究者にとって重要です。しかし、一次LECの培養は、入手可能性が限られていること、増殖速度が遅いこと、デリケートな性質のため、長い間課題となっていました。
この研究は、一次LEC培養の包括的なプロトコルを提示することにより、これらのハードルに対処します。このプロトコルには、最適化された培地の調合、水晶体カプセルの正確な単離、トリプシン処理技術、継代培養手順、収穫プロトコル、保管と出荷のガイドラインなどの重要なステップが含まれています。培養プロセス全体を通して、位相差顕微鏡を用いて細胞形態をモニターしました。
培養LECの真正性を確認するために、免疫蛍光アッセイを実施して、重要なレンズタンパク質、すなわちαAおよびγ-クリスタリンの存在と細胞内分布を検出しました。この詳細なプロトコールは、原発性LECの培養と特性評価のための貴重なリソースを研究者に提供し、水晶体生物学の理解の進歩と水晶体関連疾患の治療戦略の開発を可能にします。
Introduction
目の水晶体は、入射光を網膜に合わせることにより、視力において重要な役割を果たします。これは、特殊な細胞で構成される透明で無血管構造で構成されており、その中で水晶体上皮細胞(LEC)が重要な役割を担っています。LECは水晶体の前面に位置し、水晶体の透明性を維持し、水分バランスを調節し、水晶体の成長と発達に関与する役割を担っています1,2。LECは、水晶体の前部に位置するユニークなタイプの細胞であり、生涯を通じて水晶体線維を連続的に産生することにより、水晶体の透明度と機能を維持する上で重要な役割を果たします。
白内障は、水晶体の曇りが進行し、光の歪みや散乱を引き起こし、視力の低下につながります3,4。白内障形成の根底にある正確なメカニズムは複雑で多因子的であり、紫外線、酸化損傷、糖化などのさまざまな細胞および分子プロセスが関与しています5,6。LECは白内障の発症に大きく寄与することがわかっており、研究の重要な焦点となっています1,2,7,8,9。
さらに、今日の眼科における最も差し迫った問題の1つは、二次性白内障としても知られる後嚢混濁(PCO)の発生率が比較的高いことです。PCOは白内障手術後も最も一般的な合併症であり、手術後5年以内に成人患者の最大20〜40%、小児の100%が罹患します10。PCOは主に、白内障摘出後に莢膜バッグに残る残留LECによって引き起こされます。これらの細胞は、上皮から間葉への移行(EMT)だけでなく、LECから水晶体線維への分化を含む多面的な病態生理学的形質転換を受け、LEC、線維、筋線維芽細胞の混合物である細胞集団をもたらします11,12,13。形質転換された細胞は増殖し、後部水晶体嚢を横切って移動し、視力障害を引き起こします。培養モデルにおけるLECの挙動と制御メカニズムを理解することは、PCOの予防と管理に関する貴重な洞察を提供することができます。したがって、LECを培養するこのプロトコルは、この一般的な術後合併症を研究し、理解し、最終的に戦うことを目指す眼科研究者にとって重要なツールを提供します。
LEC生物学の複雑さと、白内障形成およびPCOにおけるLECの役割を解明するには、頑健で再現性の高い in vitro 初代細胞培養システムを確立することが不可欠です。初代LEC培養は、LECの機能、シグナル伝達、および分子特性を研究するための制御された環境を研究者に提供します。さらに、細胞プロセスやさまざまな実験条件の影響を調べることができ、水晶体の生理学や病理学に関する貴重な洞察を得ることができます。
以前の研究により、LEC培養技術の理解が深まりました14、15、16、17、18、19、20。これらの研究はさまざまな方法論を採用し、LECの行動と特性に関する重要な発見をもたらしましたが、LECを培養するための包括的でアクセス可能なビデオ録画プロトコルは現在の文献にはありません。この制限は、初心者の研究者が技術を正確に再現する能力を妨げ、実験結果の不整合やばらつきにつながる可能性があります。この研究論文は、ビデオ録画プロトコルを提供することにより、このギャップを埋め、LEC培養の分野で再現性を高め、知識の伝達を促進することができる標準化されたリソースを提供することを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文で紹介するプロトコールは、一次LECの単離、培養、および継代培養を成功させるための包括的なステップバイステップガイドを提供し、付属のビデオドキュメントを完備しています。詳細なビジュアルガイドと書面による指示により、プロトコルの明確さとアクセス性が向上し、この分野の研究者の間での使用と再現性が促進されます。最終的な目的は、白内障形成とPCO、白内障手?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NEI R21EY033941 (to Hongli Wu) の支援を受けました。国防総省W81XWH2010896(Hongli Wuへ);R15GM123463-02 (へ Kayla Green and Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
Referenzen
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Entwicklungsbiologie. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
