获得全兔眼的高质量冷冻切片
Summary
该协议描述了一种获得整个兔眼的高质量冷冻切片的可靠方法。它详细介绍了兔眼的解剖、固定、嵌入和切片程序，这些程序可以很容易地用于任何利用免疫组化在大眼睛中的研究。
Abstract
该协议描述了如何在较大的动物（如兔子）中获得高质量的视网膜冷冻切片。摘除后，将眼睛短暂浸入固定剂中。然后，去除角膜和虹膜，将眼睛放置过夜，以便在4°C下进行额外固定。 固定后，将镜片取下。然后将眼睛放入冷冻模型中，并填充嵌入培养基。通过去除晶状体，嵌入介质可以更好地进入玻璃体，并导致更好的视网膜稳定性。重要的是，眼睛应在包埋培养基中孵育过夜，以使眼睛完全浸润整个玻璃体。孵育过夜后，将眼睛冷冻在干冰上并切片。可以获取整个视网膜切片用于免疫组化。标准染色方案可用于研究视网膜组织内抗原的定位。遵守该协议可产生高质量的视网膜冷冻切片，可用于任何利用免疫组织化学的实验。
Introduction
视网膜由眼睛内的几层特化细胞组成，这些细胞共同将光转化为神经信号。由于视网膜在视力中起着至关重要的作用，因此了解其结构和功能可以为视力丧失的一些最常见原因提供有价值的见解，例如黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等。
兔子在视网膜研究中是一种方便的动物模型，因为与其他模型相比，它们具有多种优势。兔子的眼睛在解剖结构上与人类的眼睛相对相似 1,2。例如，兔子有一个光感受器密度增加的区域，称为水平视觉条纹，类似于人类的中央凹。其他常用的动物模型，如啮齿动物，没有解剖学上的等效物。此外，与啮齿动物相比，兔子的视网膜脉管系统与人类的视网膜血管系统相当相似。兔子的眼睛也比较大。这使得它们特别适用于涉及玻璃体或视网膜内的药物给药或手术干预的研究，否则在较小的眼睛中可能难以或不可能3.
免疫组织化学 （IHC） 是一种广泛使用的技术，用于研究组织内抗原的定位，在视网膜研究中具有广泛的应用 4,5,6。由于视网膜是一个微妙的结构，通过 IHC 获得有用的结果需要仔细的组织处理。视网膜脱离和其他组织伪影（如视网膜破裂或褶皱）通常发生在处理过程中，可能会干扰结果的解释。成功的处理取决于多种因素，包括组织操作、固定的类型和持续时间、包埋介质的类型和切片技术 7,8,9,10。尽管在视网膜研究中使用兔子作为动物模型具有优势，但很少有描述兔子视网膜成功组织处理的协议。本文描述了一种从整个兔眼获得高质量视网膜切片以用于 IHC 的可靠方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在实施上述协议之前，我们在用于 IHC 的兔眼组织处理方面一直面临困难。我们已经从小鼠等较小动物的眼睛中采用了几种方案，但发现这些方案会导致固定不足和组织切片困难。有几个重要的考虑因素可以使兔子视网膜的切片保持一致、高质量。
一个考虑因素是与其他常用的动物模型（如啮齿动物）相比，兔子球体的尺寸较大。由于兔眼的大小与人眼相似，因此可以很容易…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢 Rosanna Calderon、Dominic Shayler 和 Rosa Sierra 的技术建议。这项研究在一定程度上得到了南加州大学凯克医学院眼科的无限制赠款，包括预防失明研究 （AN）、美国国立卫生研究院 （NIH） K08EY030924、拉斯马德里纳斯眼科实验治疗学基金会 （AN）、预防失明研究职业发展奖 （AN）、骑士圣殿骑士眼科基金会基金会捐赠基金 （AN）、 以及 Edward N. 和 Della L. Thome 纪念基金会 （AN， KG）。
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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