ウサギの眼全体の高品質な凍結切片の取得
Summary
このプロトコルは、ウサギの眼全体の高品質な凍結切片を得るための信頼性の高い方法を説明しています。ウサギの眼の解剖、固定、埋め込み、および切片化の手順を詳しく説明しており、より大きな眼の免疫組織化学を利用するあらゆる研究での使用に容易に適応できます。
Abstract
このプロトコルは、ウサギなどの大型動物で高品質の網膜凍結切片を取得する方法を説明しています。除核後、眼を固定剤に短時間浸します。次に、角膜と虹彩を切除し、眼球を一晩放置して4°Cでさらに固定します。 固定後、レンズを取り外します。次に、眼球をクライオモールドに入れ、埋め込み培地で満たします。レンズを取り外すことにより、埋め込み媒体は硝子体へのアクセスを改善し、網膜の安定性を向上させます。重要なことに、眼は硝子体全体に完全に浸透できるように、埋め込み培地で一晩インキュベートする必要があります。一晩のインキュベーション後、眼をドライアイスで凍結し、切片化します。全網膜切片は、免疫組織化学で使用するために得ることができる。標準的な染色プロトコルは、網膜組織内の抗原の局在を研究するために利用できます。このプロトコルを順守することで、免疫組織化学を利用するあらゆる実験で使用できる高品質の網膜凍結切片が得られます。
Introduction
網膜は、眼内の特殊な細胞のいくつかの層で構成されており、それらが一緒になって光を神経信号に変換する働きをします。網膜は視力において重要な役割を果たしているため、その構造と機能を理解することで、黄斑変性症や糖尿病性網膜症など、視力喪失の最も一般的な原因のいくつかについて貴重な洞察を得ることができます。
ウサギは、他のモデルと比較していくつかの利点を提供するため、網膜研究において便利な動物モデルとして機能します。ウサギの目は、解剖学的構造が人間の目と比較的似ています1,2。例えば、ウサギには、ヒトの中心窩に類似した、水平視覚筋として知られる視細胞密度の増加した領域があります。げっ歯類などの他の一般的に使用される動物モデルには、解剖学的同等物がありません。さらに、げっ歯類と比較して、ウサギの網膜血管系はヒトのそれとかなり似ています。ウサギの目も比較的大きいです。これにより、硝子体または網膜内での薬物投与または外科的介入を含む研究に特に適していますが、これは小さな眼では困難または不可能である可能性があります3。
免疫組織化学(IHC)は、組織内の抗原の局在を研究するために広く使用されている手法であり、網膜研究に広く応用されています4,5,6。網膜はデリケートな構造であるため、IHCで有用な結果を得るには、慎重な組織処理が必要です。網膜剥離や、網膜の破損や襞などのその他の組織アーチファクトは、通常、処理中に発生し、結果の解釈を妨げる可能性があります。プロセシングが成功するかどうかは、組織の操作、固定の種類と持続時間、埋め込み培地の種類、切片化技術など、さまざまな要因に左右されます7,8,9,10。網膜研究においてウサギを動物モデルとして使用する利点にもかかわらず、ウサギ網膜の組織処理が成功したことを示すプロトコルはほとんど存在しません。この論文では、IHCで使用するためにウサギの眼全体から高品質の網膜切片を得るための信頼性の高い方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルを実施する前は、IHCのためのウサギの眼の組織処理に一貫して困難に直面していました。マウスなどの小動物の目からいくつかのプロトコルを適応させましたが、これらが不十分な固定と組織切片の困難につながることがわかりました。ウサギの網膜の一貫性のある高品質の切片を可能にするために、いくつかの重要な考慮事項があります。
考慮すべ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術的なアドバイスを提供してくれた Rosanna Calderon、Dominic Shayler、Rosa Sierra に感謝します。この研究は、失明を防ぐための研究(AN)、NIH K08EY030924(AN)、眼科のための実験的治療におけるラスマドリナス基金(AN)、失明を防ぐための研究キャリア開発賞(AN)、テンプル騎士団眼科財団基金(AN)、 エドワードN.アンドデラL.トーム記念財団(AN、KG)。
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
- Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
