В этом протоколе описан надежный метод получения высококачественной криосекции цельных глаз кролика. В нем подробно описаны процедуры диссекции, фиксации, встраивания и разрезания глаз кролика, которые могут быть легко адаптированы для использования в любом исследовании с использованием иммуногистохимии на больших глазах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение высококачественных криорезов цельного кроличьего глаза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом протоколе описывается, как получить высококачественную криосекцию сетчатки у более крупных животных, таких как кролики. После энуклеации глаз ненадолго погружают в фиксатор. Затем роговица и радужная оболочка удаляются, а глаз оставляют на ночь для дополнительной фиксации при температуре 4 °C. После фиксации объектив снимается. Затем глаз помещают в криомолд и заполняют средой для встраивания. При удалении хрусталика встраиваемая среда получает лучший доступ к стекловидному телу и приводит к лучшей стабильности сетчатки. Важно отметить, что глаз следует инкубировать в встраиваемой среде в течение ночи, чтобы обеспечить полную инфильтрацию по всему стекловидному телу. После ночной инкубации глаз замораживают на сухом льду и разрезают. Можно получить целые срезы сетчатки для использования в иммуногистохимии. Стандартные протоколы окрашивания могут быть использованы для изучения локализации антигенов в ткани сетчатки. Соблюдение этого протокола приводит к высококачественным криосекциям сетчатки, которые могут быть использованы в любом эксперименте с использованием иммуногистохимии.
Введение
Сетчатка состоит из нескольких слоев специализированных клеток внутри глаза, которые вместе преобразуют свет в нейронные сигналы. Поскольку сетчатка играет важнейшую роль в зрении, понимание ее структуры и функции может дать ценную информацию о некоторых из наиболее распространенных причин потери зрения, таких как дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия, среди прочих.
Кролики служат удобной животной моделью в исследованиях сетчатки, поскольку они имеют ряд преимуществ по сравнению с другими моделями. Глаза кролика относительно схожи по анатомии с человеческими глазами 1,2
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были проведены в соответствии с требованиями и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Южной Калифорнии. Четырнадцать (n = 14) кроликов в возрасте от 4 до 6 месяцев были использованы при разработке этого протокола. Использовались как самцы, так и самки животных. Все животные весили от 2,0 до 2,5 кг. Все животные содержались поодиночке. С перечнем рекомендуемых материалов и оборудования можно ознакомиться в Таблице материалов.
1. Подготовка
- Фиксирующее препарирование.
- Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-со....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После обработки тканей стандартный протокол иммунофлюоресценции может быть использован для исследования любого количества биологических процессов в сетчатке. На рисунке 3A-C представлены репрезентативные флуоресцентные изображения среза сетчатки, полученные с помощью конфокальной микроскопии. Иммуноокрашивание участка сетчатки проводили в соответствии с ранее описанным протоколом12.
Репрезентативные участки.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
До внедрения вышеуказанного протокола мы постоянно сталкивались с трудностями при обработке тканей глаз кролика на ИГХ. Мы адаптировали несколько протоколов для глаз более мелких животных, таких как мыши, но обнаружили, что они приводят к недостаточной фиксации и трудностям с разрезанием тканей. Есть несколько важных соображений, которые позволяют получить стабильные и высококачественные участки сетчатки кролика.
Одним из соображений является большой размер глобуса кролика по сравнению с други.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Выражаю благодарность Розанне Кальдерон, Доминику Шейлеру и Розе Сьерра за технические советы. Это исследование было частично поддержано неограниченным грантом для отделения офтальмологии Медицинской школы Кека Университета Южной Калифорнии от Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), Фонда Лас-Мадринас в области экспериментальной терапии для офтальмологии (AN), премии за развитие карьеры в области исследований по предотвращению слепоты (AN), Фонда глазных рыцарей тамплиеров (AN), и Мемориальный фонд Эдварда Н. и Деллы Л. Томе (AN, KG).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашка для культуры 100 мм | Corning | 353025 | Используется для диссекции (шаги 1.3, 3 и 5) |
| 50 мл Tube | Genesee Scientific | 28-106 | Для фиксации и криозащиты (шаг 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | Для криосекции (шаг 7) |
| Изогнутые ножницы | Fine Science Tools | 91500-09 | Используется для диссекции (шаги 1.3, 3 и 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Разведенный 1:1,000 в блокирующем буфере |
| Микроскоп для вскрытия | Zeiss | Stemi 2000-C | Используется для вскрытия (шаги 1.3, 3 и 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Разведенный 1:1,000 в блокирующем буфере |
| Donkey Anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Разведенный 1:1,000 в блокирующем буфере |
| Щипцы | Fine Science Tools | 91150-20 | Используется для вскрытия (шаги 1.3, 3 и 5) |
| Чехол для стекла | VWR | 48404-453 | Для криосекции (шаг 7) |
| Козий анти-SOX2 | R& D Systems | AF2018 | Разведенный 1:100 в блокирующем буфере |
| Высокопрофильные одноразовые криостатные лезвия | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | Для криосекции (шаг 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Используется для удаления излишков PBS или OCT (шаги 3 и 6) |
| Мышиный анти-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Разведенный 1:100 в блокирующем буфере |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Используется для криопротектора (шаг 1.2) |
| Параформальдегид 20% раствор | Электронная микроскопия Sciences | 15713 | Используется в качестве фиксатора тканей (разбавляется до 4% на этапе 1.1) |
| Peel-A-Away Одноразовая форма для встраивания (глубина 22x22x20 мм) | Polysciences, Inc. | 18646A | Используется в качестве формы для встраивания (шаг 6) |
| Фосфатный буферный физиологический раствор, 1x | Corning | 21-030-CV | Используется при приготовлении фиксатора (шаг 1.1) и криопротектора (шаг 1.2) |
| Лезвие скальпеля No 15 | Feather | 08-916-5D | Используется для вскрытия (шаги 1.3, 3 и 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Для криосекции (шаг 7) |
| Ткань-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Используется в качестве среды для встраивания (шаг 6) |
Ссылки
- Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
- Davis, F. A. T....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
