Whole Rabbit Eye의 고품질 냉동 절개 획득
Summary
이 프로토콜은 전체 토끼 눈의 고품질 냉동 절개를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 토끼 눈 절제술, 고정, 포매 및 절편 절차에 대해 자세히 설명하며, 이는 큰 눈에 면역조직화학을 활용하는 모든 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜은 토끼와 같은 대형 동물에서 고품질 망막 동결 절개를 얻는 방법을 설명합니다. 적출 후, 눈은 잠시 고정제에 담뱉니다. 그런 다음 각막과 홍채를 제거하고 눈을 하룻밤 동안 방치하여 4 °C에서 추가로 고정합니다. 고정 후 렌즈를 제거합니다. 그런 다음 눈을 빙결 금형에 넣고 매립 매체로 채웁니다. 수정체를 제거함으로써 매립 매체가 유리체에 더 잘 접근할 수 있고 망막 안정성이 향상됩니다. 중요한 것은 유리체 전체에 완전히 침투할 수 있도록 눈을 밤새 매립 배지에서 배양해야 한다는 것입니다. 하룻밤 동안 배양한 후 눈을 드라이아이스에 얼려 절편합니다. 면역조직화학(immunohistochemistry)에 사용하기 위해 전체 망막 절편을 얻을 수 있습니다. 표준 염색 프로토콜은 망막 조직 내 항원의 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 준수하면 면역조직화학을 활용하는 모든 실험에 사용할 수 있는 고품질 망막 동결 절제술을 얻을 수 있습니다.
Introduction
망막은 눈 안에 있는 여러 층의 특수 세포로 구성되어 있으며, 이 세포들이 함께 작용하여 빛을 신경 신호로 변환합니다. 망막은 시력에 중요한 역할을 하기 때문에 망막의 구조와 기능을 이해하면 황반변성 및 당뇨병성 망막병증과 같은 시력 상실의 가장 흔한 원인에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
토끼는 다른 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 망막 연구에서 편리한 동물 모델 역할을 합니다. 토끼 눈은 해부학적으로 인간의 눈과 비교적 유사합니다 1,2. 예를 들어, 토끼는 수평 시각 줄무늬(horizontal visual streak)로 알려진 광수용체 밀도가 증가한 영역을 가지고 있으며, 이는 인간의 중심와(fovea)와 유사합니다. 설치류와 같이 일반적으로 사용되는 다른 동물 모델에는 해부학적 등가물이 없습니다. 또한 설치류와 비교했을 때 토끼의 망막 혈관 구조는 인간의 망막 혈관 구조와 상당히 유사합니다. 토끼 눈도 비교적 큽니다. 따라서 작은 눈에서는 어렵거나 불가능할 수 있는 유리체 또는 망막 내 약물 투여 또는 외과적 개입과 관련된 연구에 특히 적합합니다3.
면역조직화학(IHC)은 조직 내 항원의 국소화를 연구하는 데 널리 사용되는 기법으로, 망막 연구에서 광범위하게 응용되고 있습니다 4,5,6. 망막은 섬세한 구조이기 때문에 IHC를 통해 유용한 결과를 얻으려면 신중한 조직 처리가 필요합니다. 망막 박리 및 망막 파단 또는 접힘과 같은 기타 조직 아티팩트는 일반적으로 처리 중에 발생하며 결과 해석을 방해할 수 있습니다. 성공적인 처리는 조직 조작, 고정 유형 및 지속 시간, 매끼 배지 유형 및 절편 기술을 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다 7,8,9,10. 망막 연구에서 토끼를 동물 모델로 사용하는 이점에도 불구하고 토끼 망막의 성공적인 조직 처리를 설명하는 프로토콜은 거의 없습니다. 이 논문은 IHC에 사용하기 위해 전체 토끼 눈에서 고품질 망막 절편을 얻는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜을 구현하기 전에 우리는 IHC를 위해 토끼 눈의 조직 처리에 지속적으로 어려움을 겪었습니다. 우리는 생쥐와 같은 작은 동물의 눈에서 몇 가지 프로토콜을 적용했지만 이러한 프로토콜이 부적절한 고정과 조직 절개의 어려움으로 이어진다는 것을 발견했습니다. 토끼 망막의 일관되고 고품질의 절편을 가능하게 하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.
한 가…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 자문을 제공해 주신 Rosanna Calderon, Dominic Shayler, Rosa Sierra에게 감사드립니다. 이 연구는 USC 켁 의과대학 안과에 대한 무제한적인 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 실명 방지 연구(AN), NIH K08EY030924(AN), 안과를 위한 실험적 치료법의 Las Madrinas Endowment(AN), 실명 예방 경력 개발상(AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment(AN), Edward N. and Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG)이 있습니다.
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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