Ottenere criosezioni di alta qualità dell'intero occhio di coniglio

Summary

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell’occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l’uso in qualsiasi studio che utilizza l’immunoistochimica negli occhi più grandi.

Abstract

Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l’enucleazione, l’occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l’iride vengono rimosse e l’occhio viene lasciato per una notte per un’ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L’occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l’occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l’incubazione notturna, l’occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l’uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all’interno del tessuto retinico. L’adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l’immunoistochimica.

Introduction

La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all’interno dell’occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.

I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell’anatomia agli occhi umani ^1,2. Ad esempio, i conigli hanno un’area di maggiore densità dei fotorecettori, nota come striscia visiva orizzontale, che è analoga alla fovea negli esseri umani. Altri modelli animali di uso comune, come i roditori, non hanno un equivalente anatomico. Inoltre, rispetto ai roditori, la vascolarizzazione retinica nei conigli è abbastanza simile a quella dell’uomo. Anche gli occhi di coniglio sono relativamente grandi. Ciò li rende particolarmente adatti per studi che prevedono la somministrazione di farmaci o interventi chirurgici all’interno del vitreo o della retina che altrimenti potrebbero essere difficili o impossibili in un occhio più piccolo³.

L’immunoistochimica (IHC) è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la localizzazione degli antigeni all’interno di un tessuto e ha ampie applicazioni nella ricerca retinica ^4,5,6. Poiché la retina è una struttura delicata, ottenere risultati utili tramite IHC richiede un’attenta elaborazione dei tessuti. Il distacco della retina e altri artefatti tissutali come rotture o pieghe retiniche si verificano comunemente durante l’elaborazione e possono interferire con l’interpretazione dei risultati. Il successo dell’elaborazione dipende da una varietà di fattori, tra cui la manipolazione dei tessuti, il tipo e la durata della fissazione, il tipo di terreno di inclusione e le tecniche di sezionamento 7,8,9,10. Nonostante i vantaggi dell’utilizzo dei conigli come modello animale nella ricerca retinica, esistono pochissimi protocolli che descrivono il successo dell’elaborazione tissutale della retina del coniglio. Questo articolo descrive un metodo affidabile per ottenere sezioni retiniche di alta qualità da occhi di coniglio interi per l’uso nell’IHC.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Southern California. Quattordici (n = 14) conigli con cintura olandese di età compresa tra 4 e 6 mesi sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo. Venivano utilizzati sia animali maschi che femmine. Tutti gli animali pesavano tra 2,0 e 2,5 kg. Tutti gli animali erano alloggiati singolarmente. Un elenco dei materiali e delle attrezzature consigliate è disponibile ne…

Representative Results

Dopo l’elaborazione dei tessuti, un protocollo standard di immunofluorescenza può essere utilizzato per studiare un numero qualsiasi di processi biologici all’interno della retina. Le figure 3A-C illustrano immagini a fluorescenza rappresentative di una sezione retinica ottenute tramite microscopia confocale. La sezione retinica è stata immunocolorata secondo un protocollo12 precedentemente descritto. Le …

Discussion

Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l’elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l’IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.

Una considerazion…

Materials

100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)