Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell’occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l’uso in qualsiasi studio che utilizza l’immunoistochimica negli occhi più grandi.
Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l’enucleazione, l’occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l’iride vengono rimosse e l’occhio viene lasciato per una notte per un’ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L’occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l’occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l’incubazione notturna, l’occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l’uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all’interno del tessuto retinico. L’adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l’immunoistochimica.
La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all’interno dell’occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.
I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell’anatomia agli occhi umani 1,2. Ad esempio, i conigli hanno un’area di maggiore densità dei fotorecettori, nota come striscia visiva orizzontale, che è analoga alla fovea negli esseri umani. Altri modelli animali di uso comune, come i roditori, non hanno un equivalente anatomico. Inoltre, rispetto ai roditori, la vascolarizzazione retinica nei conigli è abbastanza simile a quella dell’uomo. Anche gli occhi di coniglio sono relativamente grandi. Ciò li rende particolarmente adatti per studi che prevedono la somministrazione di farmaci o interventi chirurgici all’interno del vitreo o della retina che altrimenti potrebbero essere difficili o impossibili in un occhio più piccolo3.
L’immunoistochimica (IHC) è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la localizzazione degli antigeni all’interno di un tessuto e ha ampie applicazioni nella ricerca retinica 4,5,6. Poiché la retina è una struttura delicata, ottenere risultati utili tramite IHC richiede un’attenta elaborazione dei tessuti. Il distacco della retina e altri artefatti tissutali come rotture o pieghe retiniche si verificano comunemente durante l’elaborazione e possono interferire con l’interpretazione dei risultati. Il successo dell’elaborazione dipende da una varietà di fattori, tra cui la manipolazione dei tessuti, il tipo e la durata della fissazione, il tipo di terreno di inclusione e le tecniche di sezionamento 7,8,9,10. Nonostante i vantaggi dell’utilizzo dei conigli come modello animale nella ricerca retinica, esistono pochissimi protocolli che descrivono il successo dell’elaborazione tissutale della retina del coniglio. Questo articolo descrive un metodo affidabile per ottenere sezioni retiniche di alta qualità da occhi di coniglio interi per l’uso nell’IHC.
Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l’elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l’IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.
Una considerazion…
The authors have nothing to disclose.
Grazie a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra per la consulenza tecnica. Questo studio è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia presso la USC Keck School of Medicine dalla ricerca per prevenire la cecità (AN), NIH K08EY030924 (AN), il Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), un premio per lo sviluppo della carriera (AN) per la ricerca per prevenire la cecità, Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e la Edward N. e Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).
100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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