השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג קריוסקציות רשתית באיכות גבוהה בבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות. לאחר האינוקלציה, העין שקועה לזמן קצר בקיבוע. לאחר מכן, הקרנית והקשתית מוסרים והעין נשארת לילה לקיבוע נוסף ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העדשה מוסרת. לאחר מכן מכניסים את העין לקריומולד וממלאים אותה במדיום הטבעה. על ידי הסרת העדשה, למדיום ההטבעה יש גישה טובה יותר לזגוגית ומוביל ליציבות רשתית טובה יותר. חשוב לציין, יש לדגור את העין בהטבעה בינונית למשך הלילה כדי לאפשר חדירה מלאה לכל הזגוגית. לאחר הדגירה בלילה, העין קפואה על קרח יבש ונחתכת. ניתן להשיג קטעי רשתית שלמים לשימוש באימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים כדי לחקור את הלוקליזציה של אנטיגנים ברקמת הרשתית. היצמדות לפרוטוקול זה מביאה לקריוסקציות רשתית באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן בכל ניסוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
הרשתית מורכבת מכמה שכבות של תאים מתמחים בתוך העין שיחד פועלים להמרת אור לאותות עצביים. מכיוון שהרשתית ממלאת תפקיד קריטי בראייה, הבנת המבנה והתפקוד שלה יכולה לספק תובנות חשובות לגבי כמה מהגורמים הנפוצים ביותר לאובדן ראייה כגון ניוון מקולרי ורטינופתיה סוכרתית, בין היתר.
ארנבים משמשים כמודל נוח לבעלי חיים במחקר רשתית מכיוון שהם מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים. עיני ארנב דומות יחסית באנטומיה לעיניים אנושיות 1,2. לדוגמה, לארנבים יש אזור של צפיפות פוטורצפטור מוגברת, המכונה פס חזותי אופקי, המקביל לגומה המרכזית בבני אדם. למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים, כגון מכרסמים, אין מקבילה אנטומית. בנוסף, בהשוואה למכרסמים, כלי הדם ברשתית בארנבים דומים למדי לאלה שבבני אדם. עיני ארנב גדולות יחסית גם כן. זה הופך אותם למתאימים במיוחד למחקרים הכוללים מתן תרופות או התערבות כירורגית בתוך הזגוגית או הרשתית שאחרת עשויים להיות קשים או בלתי אפשריים בעין קטנהיותר 3.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה נפוצה לחקר לוקליזציה של אנטיגנים בתוך רקמה ויש לה יישומים נרחבים במחקר רשתית 4,5,6. מכיוון שהרשתית היא מבנה עדין, השגת תוצאות שימושיות באמצעות IHC דורשת עיבוד רקמות זהיר. היפרדות רשתית וממצאים רקמתיים אחרים כגון שברים ברשתית או קפלים מתרחשים בדרך כלל במהלך העיבוד ועלולים להפריע לפרשנות התוצאות. עיבוד מוצלח תלוי במגוון גורמים, כולל מניפולציה של רקמות, סוג ומשך הקיבוע, סוג מדיה הטבעה וטכניקות חתך 7,8,9,10. למרות היתרונות של שימוש בארנבים כמודל לבעלי חיים במחקר רשתית, קיימים מעט מאוד פרוטוקולים המתארים עיבוד רקמות מוצלח של רשתית הארנבת. מאמר זה מתאר שיטה אמינה להשגת חתכי רשתית באיכות גבוהה מעיני ארנב שלמות לשימוש ב- IHC.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפני יישום הפרוטוקול הנ”ל, נתקלנו באופן עקבי בקשיים בעיבוד רקמות של עיני ארנב עבור IHC. התאמנו כמה פרוטוקולים מעיניהם של בעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים, אך מצאנו שהם מובילים לקיבוע לקוי ולקושי בחיתוך רקמות. ישנם מספר שיקולים חשובים המאפשרים חלקים עקביים ואיכותיים של רשתית הארנבת.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לרוזנה קלדרון, דומיניק שיילר ורוזה סיירה על הייעוץ הטכני. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים בבית הספר לרפואה של USC Keck ממחקר למניעת עיוורון (AN), NIH K08EY030924 (AN), קרן לאס מדרינאס בטיפולים ניסיוניים לרפואת עיניים (AN), פרס מחקר למניעת עיוורון לפיתוח קריירה (AN), קרן העיניים הטמפלרית (AN), וקרן הזיכרון ע”ש אדוארד נ’ ודלה ל’ ת’ום (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
- Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
