Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi
Summary
Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.
Abstract
Bu protokol, tavşanlar gibi daha büyük hayvanlarda yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonların nasıl elde edileceğini açıklar. Enükleasyondan sonra, göz kısa bir süre fiksatife daldırılır. Daha sonra kornea ve iris çıkarılır ve göz 4 °C’de ek fiksasyon için gece boyunca bırakılır. Sabitlemeyi takiben lens çıkarılır. Göz daha sonra bir kriyokalıba yerleştirilir ve bir gömme ortamı ile doldurulur. Lensi çıkararak, gömme ortamı vitreusa daha iyi erişebilir ve daha iyi retina stabilitesine yol açar. Daha da önemlisi, vitreus boyunca tam sızmaya izin vermek için göz gece boyunca gömme ortamında inkübe edilmelidir. Gece boyunca inkübasyondan sonra göz kuru buz üzerinde dondurulur ve kesitlere ayrılır. İmmünohistokimyada kullanılmak üzere tüm retina kesitleri elde edilebilir. Retina dokusu içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için standart boyama protokolleri kullanılabilir. Bu protokole uyulması, immünohistokimya kullanan herhangi bir deneyde kullanılabilecek yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonlar ile sonuçlanır.
Introduction
Retina, göz içinde ışığı nöral sinyallere dönüştürmek için birlikte çalışan birkaç özel hücre katmanından oluşur. Retina görmede kritik bir rol oynadığından, yapısını ve işlevini anlamak, diğerlerinin yanı sıra makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati gibi görme kaybının en yaygın nedenlerinden bazıları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Tavşanlar, diğer modellere kıyasla çeşitli avantajlar sundukları için retina araştırmalarında uygun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Tavşan gözleri anatomik olarak insan gözlerine nispeten benzer 1,2. Örneğin, tavşanlar, insanlardaki foveaya benzer şekilde, yatay görsel çizgi olarak bilinen artmış bir fotoreseptör yoğunluğu alanına sahiptir. Kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan diğer hayvan modellerinin anatomik bir eşdeğeri yoktur. Ek olarak, kemirgenlerle karşılaştırıldığında, tavşanlardaki retina damar sistemi insanlardakine oldukça benzer. Tavşan gözleri de nispeten büyüktür. Bu, onları vitreus veya retina içinde ilaç uygulamasını veya cerrahi müdahaleyi içeren çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, aksi takdirde daha küçük bir gözde zor veya imkansız olabilir3.
İmmünohistokimya (IHC), bir doku içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir 4,5,6. Retina hassas bir yapı olduğundan, IHC ile faydalı sonuçlar elde etmek dikkatli bir doku işlemi gerektirir. Retina dekolmanı ve retina kırılmaları veya kıvrımları gibi diğer doku artefaktları genellikle işleme sırasında ortaya çıkar ve sonuçların yorumlanmasını engelleyebilir. Başarılı işleme, doku manipülasyonu, fiksasyonun türü ve süresi, gömme ortamının türü ve kesit alma teknikleri 7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Retina araştırmalarında tavşanların bir hayvan modeli olarak kullanılmasının avantajlarına rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu makale, IHC’de kullanılmak üzere bütün tavşan gözlerinden yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokolü uygulamadan önce, IHC için tavşan gözlerinin doku işlemesinde sürekli olarak zorluklarla karşılaştık. Fareler gibi daha küçük hayvanların gözlerinden birkaç protokol uyarladık, ancak bunların yetersiz fiksasyona ve doku kesitinde zorluğa yol açtığını gördük. Tavşan retinasının tutarlı, yüksek kaliteli bölümlerine izin veren birkaç önemli husus vardır.
Dikkate alınması gereken bir husus, kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan di?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik tavsiyeler için Rosanna Calderon, Dominic Shayler ve Rosa Sierra’ya teşekkürler. Bu çalışma kısmen, USC Keck Tıp Fakültesi Oftalmoloji Bölümü’ne Körlüğü Önleme Araştırmaları (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Oftalmoloji için Deneysel Terapötikler Vakfı (AN), Körlüğü Önleme Araştırması Kariyer Geliştirme Ödülü (AN), Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı Vakfı (AN), ve Edward N. ve Della L. Thome Anma Vakfı (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
- Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
