Obtención de criosecciones de alta calidad de ojo de conejo entero
Summary
Este protocolo describe un método fiable para obtener criosecciones de alta calidad de ojos de conejo enteros. En él se detallan los procedimientos de disección, fijación, inclusión y seccionamiento de ojos de conejo, que pueden adaptarse fácilmente para su uso en cualquier estudio que utilice inmunohistoquímica en ojos más grandes.
Abstract
Este protocolo describe cómo obtener criosecciones de retina de alta calidad en animales más grandes, como conejos. Después de la enucleación, el ojo se sumerge brevemente en el fijador. A continuación, se extraen la córnea y el iris y se deja el ojo toda la noche para una fijación adicional a 4 °C. Después de la fijación, se retira la lente. A continuación, el ojo se coloca en un criomold y se llena con un medio de inclusión. Al retirar el cristalino, el medio de inclusión tiene un mejor acceso al vítreo y conduce a una mejor estabilidad de la retina. Es importante destacar que el ojo debe incubarse en un medio de inclusión durante la noche para permitir una infiltración completa en todo el vítreo. Después de la incubación durante la noche, el ojo se congela en hielo seco y se secciona. Se pueden obtener secciones completas de la retina para su uso en inmunohistoquímica. Se pueden utilizar protocolos de tinción estándar para estudiar la localización de antígenos dentro del tejido de la retina. El cumplimiento de este protocolo da como resultado criosecciones de retina de alta calidad que se pueden utilizar en cualquier experimento que utilice inmunohistoquímica.
Introduction
La retina está compuesta por varias capas de células especializadas dentro del ojo que juntas trabajan para convertir la luz en señales neuronales. Debido a que la retina desempeña un papel fundamental en la visión, la comprensión de su estructura y función puede proporcionar información valiosa sobre algunas de las causas más comunes de pérdida de visión, como la degeneración macular y la retinopatía diabética, entre otras.
Los conejos sirven como un modelo animal conveniente en la investigación de la retina, ya que ofrecen varias ventajas en comparación con otros modelos. Los ojos de conejo son relativamente similares en anatomía a los ojos humanos 1,2. Por ejemplo, los conejos tienen un área de mayor densidad de fotorreceptores, conocida como raya visual horizontal, que es análoga a la fóvea de los humanos. Otros modelos animales comúnmente utilizados, como los roedores, no tienen un equivalente anatómico. Además, en comparación con los roedores, la vasculatura de la retina de los conejos es bastante similar a la de los humanos. Los ojos de conejo también son relativamente grandes. Esto los hace especialmente adecuados para estudios que implican la administración de fármacos o la intervención quirúrgica dentro del vítreo o la retina que, de otro modo, podrían ser difíciles o imposibles en un ojo más pequeño3.
La inmunohistoquímica (IHQ) es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la localización de antígenos dentro de un tejido y tiene amplias aplicaciones en la investigación de la retina 4,5,6. Debido a que la retina es una estructura delicada, la obtención de resultados útiles a través de IHQ requiere un procesamiento cuidadoso de los tejidos. El desprendimiento de retina y otros artefactos tisulares, como roturas o pliegues de retina, ocurren comúnmente durante el procesamiento y pueden interferir con la interpretación de los resultados. El procesamiento exitoso depende de una variedad de factores, incluyendo la manipulación del tejido, el tipo y la duración de la fijación, el tipo de medio de inclusión y las técnicas de corte 7,8,9,10. A pesar de las ventajas de utilizar conejos como modelo animal en la investigación de la retina, existen muy pocos protocolos que describan el procesamiento exitoso de los tejidos de la retina del conejo. Este artículo describe un método confiable para obtener secciones de retina de alta calidad de ojos de conejo enteros para su uso en IHQ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes de implementar el protocolo anterior, nos enfrentábamos constantemente a dificultades con el procesamiento de tejidos de ojos de conejo para IHQ. Habíamos adaptado varios protocolos de los ojos de animales más pequeños, como ratones, pero descubrimos que estos conducían a una fijación inadecuada y a dificultades con el corte de tejidos. Hay varias consideraciones importantes que permiten secciones consistentes y de alta calidad de la retina del conejo.
Una consideración es el gran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Rosanna Calderón, Dominic Shayler y Rosa Sierra por su asesoría técnica. Este estudio fue financiado en parte por una subvención sin restricciones al Departamento de Oftalmología de la Facultad de Medicina Keck de la USC de Investigación para Prevenir la Ceguera (AN), NIH K08EY030924 (AN), la Fundación Las Madrinas en Terapéutica Experimental para la Oftalmología (AN), un Premio al Desarrollo Profesional de Investigación para Prevenir la Ceguera (AN), Fundación Oftalmológica de los Caballeros Templarios (AN), y la Fundación Conmemorativa Edward N. y Della L. Thome (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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