Obtenção de criosecções de alta qualidade de olho de coelho inteiro
Summary
Este protocolo descreve um método confiável para obter criosseções de alta qualidade de olhos inteiros de coelho. Ele detalha os procedimentos de dissecção, fixação, incorporação e seccionamento do olho do coelho, que podem ser facilmente adaptados para uso em qualquer estudo que utilize imuno-histoquímica em olhos maiores.
Abstract
Este protocolo descreve como obter criossecções retinianas de alta qualidade em animais maiores, como coelhos. Após a enucleação, o olho é brevemente imerso no fixador. Em seguida, a córnea e a íris são removidas e o olho é deixado durante a noite para fixação adicional a 4 °C. Após a fixação, a lente é removida. O olho é então colocado em um criomold e preenchido com um meio de inclusão. Ao remover a lente, o meio de incorporação tem melhor acesso ao vítreo e leva a uma melhor estabilidade da retina. É importante ressaltar que o olho deve ser incubado em meio de incorporação durante a noite para permitir a infiltração completa em todo o vítreo. Após a incubação durante a noite, o olho é congelado em gelo seco e seccionado. Cortes retinianos inteiros podem ser obtidos para uso em imuno-histoquímica. Protocolos de coloração padrão podem ser utilizados para estudar a localização de antígenos no tecido retiniano. A adesão a este protocolo resulta em criossecções retinianas de alta qualidade que podem ser usadas em qualquer experimento que utilize imuno-histoquímica.
Introduction
A retina é composta por várias camadas de células especializadas dentro do olho que, juntas, trabalham para converter a luz em sinais neurais. Como a retina desempenha um papel crítico na visão, entender sua estrutura e função pode fornecer informações valiosas sobre algumas das causas mais comuns de perda de visão, como degeneração macular e retinopatia diabética, entre outras.
Os coelhos servem como um modelo animal conveniente na pesquisa da retina, pois oferecem várias vantagens em comparação com outros modelos. Os olhos de coelho são relativamente semelhantes em anatomia aos olhos humanos 1,2. Por exemplo, os coelhos têm uma área de densidade aumentada de fotorreceptores, conhecida como faixa visual horizontal, que é análoga à fóvea em humanos. Outros modelos animais comumente usados, como roedores, não têm um equivalente anatômico. Além disso, em comparação com os roedores, a vasculatura da retina em coelhos é bastante semelhante à dos humanos. Os olhos do coelho também são relativamente grandes. Isso os torna particularmente adequados para estudos que envolvem administração de medicamentos ou intervenção cirúrgica no vítreo ou na retina que, de outra forma, poderiam ser difíceis ou impossíveis em um olho menor3.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica amplamente utilizada para estudar a localização de antígenos dentro de um tecido e tem amplas aplicações na pesquisa da retina 4,5,6. Como a retina é uma estrutura delicada, a obtenção de resultados úteis via IHC requer um processamento cuidadoso do tecido. O descolamento de retina e outros artefatos teciduais, como quebras ou dobras da retina, geralmente ocorrem durante o processamento e podem interferir na interpretação dos resultados. O processamento bem-sucedido depende de uma variedade de fatores, incluindo manipulação do tecido, tipo e duração da fixação, tipo de meio de incorporação e técnicas de seccionamento 7,8,9,10. Apesar das vantagens de usar coelhos como modelo animal na pesquisa da retina, existem muito poucos protocolos que descrevem o processamento bem-sucedido do tecido da retina do coelho. Este artigo descreve um método confiável para obter seções retinianas de alta qualidade de olhos inteiros de coelho para uso em IHQ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes de implementar o protocolo acima, enfrentamos consistentemente dificuldades com o processamento tecidual de olhos de coelho para IHQ. Adaptamos vários protocolos dos olhos de animais menores, como camundongos, mas descobrimos que eles levavam a uma fixação inadequada e dificuldade de seccionamento do tecido. Existem várias considerações importantes que permitem seções consistentes e de alta qualidade da retina do coelho.
Uma consideração é o grande tamanho do globo do coelho e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Obrigado a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra pelo aconselhamento técnico. Este estudo foi apoiado em parte por uma doação irrestrita ao Departamento de Oftalmologia da USC Keck School of Medicine de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e a Fundação Memorial Edward N. e Della L. Thome (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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