Het verkrijgen van cryosecties van het hele konijnenoog van hoge kwaliteit
Summary
Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties van hele konijnenogen. Het beschrijft procedures voor dissectie, fixatie, inbedding en secties van konijnenogen, die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor gebruik in elk onderzoek waarbij immunohistochemie in grotere ogen wordt gebruikt.
Abstract
Dit protocol beschrijft hoe je hoogwaardige retinale cryosecties kunt verkrijgen bij grotere dieren, zoals konijnen. Na enucleatie wordt het oog kort ondergedompeld in het fixeermiddel. Vervolgens worden het hoornvlies en de iris verwijderd en wordt het oog een nacht gelaten voor extra fixatie bij 4 °C. Na fixatie wordt de lens verwijderd. Het oog wordt vervolgens in een cryomal geplaatst en gevuld met een inbeddingsmedium. Door de lens te verwijderen, heeft het inbeddingsmedium een betere toegang tot het glasvocht en leidt dit tot een betere stabiliteit van het netvlies. Belangrijk is dat het oog ‘s nachts in inbeddingsmedium moet worden geïncubeerd om volledige infiltratie door het glasvocht mogelijk te maken. Na een nacht incubatie wordt het oog op droogijs ingevroren en in doorsneden gesneden. Hele netvliescoupes kunnen worden verkregen voor gebruik in de immunohistochemie. Standaard kleuringsprotocollen kunnen worden gebruikt om de lokalisatie van antigenen in het netvliesweefsel te bestuderen. Naleving van dit protocol resulteert in hoogwaardige retinale cryosecties die kunnen worden gebruikt in elk experiment met behulp van immunohistochemie.
Introduction
Het netvlies bestaat uit verschillende lagen gespecialiseerde cellen in het oog die samen werken om licht om te zetten in neurale signalen. Omdat het netvlies een cruciale rol speelt bij het gezichtsvermogen, kan het begrijpen van de structuur en functie ervan waardevolle inzichten opleveren in enkele van de meest voorkomende oorzaken van verlies van het gezichtsvermogen, zoals maculaire degeneratie en diabetische retinopathie.
Konijnen dienen als een handig diermodel bij netvliesonderzoek, omdat ze verschillende voordelen bieden in vergelijking met andere modellen. Konijnenogen lijken qua anatomie relatief veel op die van mensenogen 1,2. Konijnen hebben bijvoorbeeld een gebied met een verhoogde fotoreceptordichtheid, bekend als de horizontale visuele streep, die analoog is aan de fovea bij mensen. Andere veelgebruikte diermodellen, zoals knaagdieren, hebben geen anatomisch equivalent. Bovendien is het retinale vaatstelsel bij konijnen in vergelijking met knaagdieren redelijk vergelijkbaar met dat bij mensen. Konijnenogen zijn ook relatief groot. Dit maakt ze bijzonder geschikt voor onderzoeken waarbij geneesmiddelen worden toegediend of een chirurgische ingreep in het glasvocht of het netvlies die anders moeilijk of onmogelijk zou zijn in een kleineroog3.
Immunohistochemie (IHC) is een veelgebruikte techniek om de lokalisatie van antigenen in een weefsel te bestuderen en heeft brede toepassingen in netvliesonderzoek 4,5,6. Omdat het netvlies een delicate structuur is, vereist het verkrijgen van bruikbare resultaten via IHC een zorgvuldige weefselverwerking. Netvliesloslating en andere weefselartefacten zoals netvliesbreuken of -plooien komen vaak voor tijdens de verwerking en kunnen de interpretatie van de resultaten verstoren. Succesvolle verwerking hangt af van verschillende factoren, waaronder weefselmanipulatie, type en duur van fixatie, type inbeddingsmedia en sectietechnieken 7,8,9,10. Ondanks de voordelen van het gebruik van konijnen als diermodel in netvliesonderzoek, bestaan er maar heel weinig protocollen die een succesvolle weefselverwerking van het netvlies van konijnen beschrijven. Dit artikel beschrijft een betrouwbare methode voor het verkrijgen van hoogwaardige netvliescoupes van hele konijnenogen voor gebruik bij IHC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voorafgaand aan de implementatie van het bovenstaande protocol hebben we consequent problemen ondervonden met de weefselverwerking van konijnenogen voor IHC. We hadden verschillende protocollen aangepast aan de ogen van kleinere dieren zoals muizen, maar ontdekten dat deze leidden tot onvoldoende fixatie en problemen met weefselsectie. Er zijn verschillende belangrijke overwegingen die zorgen voor consistente, hoogwaardige secties van het netvlies van konijnen.
Een overweging is de grote omvan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Met dank aan Rosanna Calderon, Dominic Shayler en Rosa Sierra voor technisch advies. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde van de USC Keck School of Medicine van Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), de Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), een Research to Prevent Blindness Career Development Award (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), en de Edward N. en Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
- Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
.