Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte ganzer Kaninchenaugen. Es beschreibt Verfahren zur Dissektion, Fixierung, Einbettung und Sektion von Kaninchenaugen, die leicht für den Einsatz in jeder Studie angepasst werden können, bei der die Immunhistochemie bei größeren Augen eingesetzt wird.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt, wie man hochwertige Netzhautkryosektionen bei größeren Tieren, wie z. B. Kaninchen, erhält. Nach der Enukleation wird das Auge kurz in das Fixiermittel getaucht. Dann werden die Hornhaut und die Iris entfernt und das Auge über Nacht bei 4 °C fixiert. Nach der Fixierung wird die Linse entfernt. Das Auge wird dann in eine Kryoform gelegt und mit einem Einbettmedium gefüllt. Durch das Entfernen der Linse hat das Einbettmedium einen besseren Zugang zum Glaskörper und führt zu einer besseren Netzhautstabilität. Wichtig ist, dass das Auge über Nacht in Einbettmedium inkubiert wird, um eine vollständige Infiltration im gesamten Glaskörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation über Nacht wird das Auge auf Trockeneis eingefroren und in Stücke geschnitten. Ganze Netzhautschnitte können für die Verwendung in der Immunhistochemie gewonnen werden. Standard-Färbeprotokolle können verwendet werden, um die Lokalisation von Antigenen im Netzhautgewebe zu untersuchen. Die Einhaltung dieses Protokolls führt zu qualitativ hochwertigen Netzhautkryosektionen, die in jedem immunhistochemischen Experiment verwendet werden können.
Introduction
Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten spezialisierter Zellen im Auge, die zusammen Licht in neuronale Signale umwandeln. Da die Netzhaut eine entscheidende Rolle für das Sehvermögen spielt, kann das Verständnis ihrer Struktur und Funktion wertvolle Einblicke in einige der häufigsten Ursachen für Sehverlust liefern, wie z. B. Makuladegeneration und diabetische Retinopathie.
Kaninchen dienen als praktisches Tiermodell in der Netzhautforschung, da sie im Vergleich zu anderen Modellen mehrere Vorteile bieten. Kaninchenaugen sind in ihrer Anatomie den menschlichen Augen relativ ähnlich 1,2. Kaninchen haben zum Beispiel einen Bereich mit erhöhter Photorezeptordichte, der als horizontaler visueller Streifen bekannt ist und der der Fovea beim Menschen entspricht. Andere häufig verwendete Tiermodelle, wie z. B. Nagetiere, haben keine anatomische Entsprechung. Darüber hinaus ist das retinale Gefäßsystem bei Kaninchen im Vergleich zu Nagetieren dem des Menschen ziemlich ähnlich. Kaninchenaugen sind auch relativ groß. Dies macht sie besonders geeignet für Studien, die die Verabreichung von Medikamenten oder chirurgische Eingriffe in den Glaskörper oder die Netzhaut beinhalten, die sonst bei einem kleineren Auge schwierig oder unmöglich sein könnten3.
Die Immunhistochemie (IHC) ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Lokalisierung von Antigenen in einem Gewebe und findet breite Anwendung in der Netzhautforschung 4,5,6. Da es sich bei der Netzhaut um eine empfindliche Struktur handelt, ist eine sorgfältige Gewebeaufbereitung erforderlich, um brauchbare Ergebnisse mit IHC zu erzielen. Netzhautablösungen und andere Gewebeartefakte wie Netzhautbrüche oder -falten treten häufig während der Verarbeitung auf und können die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Die erfolgreiche Verarbeitung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Gewebemanipulation, der Art und Dauer der Fixierung, der Art des Einbettungsmediums und der Schnitttechniken 7,8,9,10. Trotz der Vorteile der Verwendung von Kaninchen als Tiermodell in der Netzhautforschung gibt es nur sehr wenige Protokolle, die eine erfolgreiche Gewebeverarbeitung der Kaninchennetzhaut beschreiben. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Netzhautschnitte aus ganzen Kaninchenaugen für den Einsatz in der IHC beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vor der Implementierung des oben genannten Protokolls hatten wir immer wieder Schwierigkeiten bei der Gewebeverarbeitung von Kaninchenaugen für IHC. Wir hatten mehrere Protokolle aus den Augen kleinerer Tiere, wie z. B. Mäuse, angepasst, stellten aber fest, dass diese zu einer unzureichenden Fixierung und Schwierigkeiten bei der Gewebeschnittung führten. Es gibt mehrere wichtige Überlegungen, die konsistente, qualitativ hochwertige Schnitte der Netzhaut des Kaninchens ermöglichen.
Eine Ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an Rosanna Calderon, Dominic Shayler und Rosa Sierra für die technische Beratung. Diese Studie wurde teilweise durch einen uneingeschränkten Zuschuss an die Abteilung für Augenheilkunde an der USC Keck School of Medicine von Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), dem Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), einem Research to Prevent Blindness Career Development Award (AN) und der Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN) unterstützt. und die Edward N. and Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
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