الحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعين الأرنب الكاملة
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعيون الأرانب الكاملة. إنه يفصل تشريح عين الأرنب ، والتثبيت ، والتضمين ، وإجراءات التقسيم ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاستخدامها في أي دراسة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عيون أكبر.
Abstract
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على عمليات تجميد شبكية عالية الجودة في الكبيرة ، مثل الأرانب. بعد الاستئصال ، تغمر العين لفترة وجيزة في المثبت. بعد ذلك ، تتم إزالة القرنية والقزحية وتترك العين طوال الليل لتثبيت إضافي عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تتم إزالة العدسة. ثم توضع العين في cryomold وتملأ بوسط التضمين. عن طريق إزالة العدسة ، يتمتع وسيط التضمين بوصول أفضل إلى الجسم الزجاجي ويؤدي إلى استقرار أفضل للشبكية. الأهم من ذلك ، يجب تحضين العين في وسط التضمين طوال الليل للسماح بالتسلل الكامل في جميع أنحاء الجسم الزجاجي. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تجميد العين على الثلج الجاف وتقسيمها. يمكن الحصول على أقسام شبكية كاملة لاستخدامها في الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن استخدام بروتوكولات التلوين القياسية لدراسة توطين المستضدات داخل أنسجة الشبكية. يؤدي الالتزام بهذا البروتوكول إلى عمليات تجميد شبكية عالية الجودة يمكن استخدامها في أي تجربة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية.
Introduction
تتكون شبكية العين من عدة طبقات من الخلايا المتخصصة داخل العين التي تعمل معا على تحويل الضوء إلى إشارات عصبية. نظرا لأن شبكية العين تلعب دورا مهما في الرؤية ، فإن فهم هيكلها ووظيفتها يمكن أن يوفر رؤى قيمة لبعض الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر مثل الضمور البقعي واعتلال الشبكية السكري ، من بين أمور أخرى.
تعمل الأرانب كنموذج حيواني مناسب في أبحاث الشبكية لأنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى. عيون الأرنب متشابهة نسبيا في علم التشريح مع عيون الإنسان 1,2. على سبيل المثال ، الأرانب لديها مساحة من كثافة مستقبلات الضوء المتزايدة ، والمعروفة باسم الخط البصري الأفقي ، والتي تشبه النقرة في البشر. النماذج الحيوانية الأخرى شائعة الاستخدام ، مثل القوارض ، ليس لها مكافئ تشريحي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع القوارض ، فإن الأوعية الدموية في شبكية العين في الأرانب تشبه إلى حد ما تلك الموجودة في البشر. عيون الأرنب كبيرة نسبيا أيضا. هذا يجعلها مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تنطوي على إعطاء الدواء أو التدخل الجراحي داخل الجسم الزجاجي أو شبكية العين التي قد تكون صعبة أو مستحيلة في عين أصغر3.
الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة توطين المستضدات داخل الأنسجة ولها تطبيقات واسعة في أبحاث الشبكية4،5،6. نظرا لأن شبكية العين عبارة عن بنية دقيقة ، فإن الحصول على نتائج مفيدة عبر IHC يتطلب معالجة دقيقة للأنسجة. يحدث انفصال الشبكية وقطع الأنسجة الأخرى مثل فواصل الشبكية أو طياتها بشكل شائع أثناء المعالجة وقد تتداخل مع تفسير النتائج. تعتمد المعالجة الناجحة على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، ونوع التثبيت ومدته ، ونوع وسائط التضمين ، وتقنيات التقسيم7،8،9،10. على الرغم من مزايا استخدام الأرانب كنموذج حيواني في أبحاث الشبكية ، يوجد عدد قليل جدا من البروتوكولات التي تصف المعالجة الناجحة لأنسجة شبكية العين. تصف هذه الورقة طريقة موثوقة للحصول على أقسام شبكية عالية الجودة من عيون الأرنب الكاملة لاستخدامها في IHC.
Protocol
Representative Results
Discussion
قبل تنفيذ البروتوكول أعلاه ، واجهنا باستمرار صعوبات في معالجة أنسجة عيون الأرانب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. لقد قمنا بتكييف العديد من البروتوكولات من عيون الصغيرة مثل الفئران ، لكننا وجدنا أنها تؤدي إلى عدم كفاية التثبيت وصعوبة تقسيم الأنسجة. هناك العديد من الاعتبارات المهمة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا لروزانا كالديرون ودومينيك شيلر وروزا سييرا على المشورة الفنية. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة غير مقيدة لقسم طب العيون في كلية الطب بجامعة جنوب كاليفورنيا كيك من البحث لمنع العمى (AN) ، المعاهد الوطنية للصحة K08EY030924 (AN) ، وقف لاس مادريناس في العلاجات التجريبية لطب العيون (AN) ، بحث لمنع العمى جائزة التطوير الوظيفي (AN) ، مؤسسة فرسان الهيكل للعيون (AN) ، ومؤسسة إدوارد ن. وديلا إل ثوم التذكارية (AN، KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
References
- Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
- Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
- Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).
- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
- Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).
- Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).
