نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.
المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) هو فحص مجهري شامل يجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري (FM) وسياق البنية الخلوية الفائقة المكتسبة بواسطة المجهر الإلكتروني (EM). CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية ، وعادة ما تعرض البنية التحتية الفائقة التألق للخطر. بالمقارنة مع راتنجات التضمين المحبة للماء الأخرى ، مثل غليسيديل ميثاكريلات أو HM20 أو K4M ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم. في السابق ، أثبتنا أن mEosEM يمكن أن ينجو من تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم وتضمين Epon. باستخدام mEosEM ، حققنا ، لأول مرة ، Epon post تضمين CLEM ، الذي يحافظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هنا ، نقدم تفاصيل خطوة بخطوة حول إعداد عينة EM ، وتصوير FM ، والتصوير EM ، ومحاذاة الصورة. نقوم أيضا بتحسين إجراءات تحديد نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة تصوير FM أثناء التصوير الكهرومغناطيسي وتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. نعتقد أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق Epon بعد تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باتباع هذا البروتوكول الجديد في مرافق EM التقليدية.
يمكن استخدام المجهر الفلوري (FM) للحصول على توطين وتوزيع البروتين المستهدف. ومع ذلك ، يتم فقدان السياق الذي يحيط بالبروتين المستهدف ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في البروتين المستهدف بدقة. يتمتع المجهر الإلكتروني (EM) بأعلى دقة تصوير ، حيث يوفر العديد من التفاصيل تحت الخلوية. ومع ذلك ، تفتقر EM إلى وضع العلامات المستهدفة. من خلال الدمج الدقيق للصورة الفلورية التي التقطتها FM مع الصورة الرمادية التي حصلت عليها EM ، يمكن للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) الجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال وضعيتي التصويرهذين 1،2،3،4.
CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية1. نظرا لقيود البروتينات الفلورية الحالية وإجراءات تحضير عينات EM التقليدية ، وخاصة استخدام حمض الأسميك (OsO4) والراتنجات الكارهة للماء مثل Epon ، فإن البنية التحتية الفائقة دائما ما تعرض التألق5 للخطر. OsO4 هو كاشف لا غنى عنه في تحضير عينات EM ، والذي يستخدم لتحسين تباين صور EM. بالمقارنة مع راتنجات التضمين الأخرى ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم5. ومع ذلك ، لا يمكن لأي بروتينات فلورية الاحتفاظ بإشارة التألق بعد معالجة OsO4 وتضمين Epon6. للتغلب على قيود البروتينات الفلورية ، تم تطوير CLEM قبل التضمين ، حيث يتم تصوير FM قبل تحضير عينة EM6. ومع ذلك ، فإن عيب التضمين المسبق CLEM هو التسجيل غير الدقيق بين صور FM و EM5.
على العكس من ذلك ، تقوم طريقة CLEM بعد التضمين بإجراء تصوير FM بعد تحضير عينة EM ، والتي يمكن أن تصل دقة تسجيلها إلى 6-7 نانومتر 5,6. للاحتفاظ بمضان البروتينات الفلورية ، تم استخدام تركيزات منخفضة جدا من OsO4 (0.001٪) 3 أو طرق تحضير EM المجمدة ذات الضغط العالي (HPF) واستبدال التجميد (FS) 4,7 على حساب البنية التحتية المخترقة أو تباين صورة EM. يعزز تطوير mEos4b بشكل كبير تقدم CLEM بعد التضمين ، على الرغم من استخدام غليسيديل ميثاكريلات كراتننجالتضمين 5. مع تطوير mEosEM ، الذي يمكنه البقاء على قيد الحياة من تلطيخ OsO4 وتضمين Epon ، تم تحقيق CLEM فائق الدقة لتضمين Epon اللاحق لأول مرة ، مع الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد6. بعد mEosEM ، تم تطوير العديد من البروتينات الفلورية التي يمكن أن تنجو من تلطيخ OsO4 وتضمين Epon8،9،10،11. هذا يعزز إلى حد كبير تطوير CLEM.
هناك ثلاثة جوانب رئيسية ل Epon بعد تضمين CLEM. الأول هو البروتين الفلوري ، الذي يجب أن يحافظ على إشارة الفلورسنت بعد تحضير عينة EM. وفقا لتجربتنا ، يتفوق mScarlet على بروتينات الفلورسنت الأخرى المبلغ عنها. والثاني هو كيفية العثور على نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة التصوير FM في التصوير الكهرومغناطيسي. لحل هذه المشكلة ، نقوم بتحسين الإجراء الخاص بهذه الخطوة حتى يتمكن المرء من العثور بسهولة على الخلية المستهدفة. الأخير هو طريقة محاذاة صورة FM مع صورة EM. هنا ، نقوم بتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. في هذا البروتوكول ، نعبر عن mScarlet في الخلايا العصبية VGLUT2 ونثبت أن mScarlet يمكن أن يستهدف الجسيمات الحالة الثانوية باستخدام Epon بعد تضمين CLEM. نحن نقدم تفاصيل خطوة بخطوة ل Epon بعد التضمين CLEM ، دون المساس بالتألق والبنية الفائقة.
البروتوكول المقدم هنا هو طريقة تصوير متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات توطين البروتين المستهدف من المجهر الضوئي (LM) والسياق المحيط بالبروتين المستهدف من المجهر الإلكتروني (EM) 6. مع قيود البروتينات الفلورية الحالية ، فإن الطريقة المستخدمة على نطاق واسع هي الت…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32201235 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (2022J01287 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في جامعة فوجيان الطبية ، الصين (XRCZX2021013 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم المالية الخاصة بمقاطعة فوجيان ، الصين (22SCZZX002 إلى Zhifei Fu) ، تأسيس مختبر NHC الرئيسي للتقييم الفني لتنظيم الخصوبة للرئيسيات غير البشرية ، ومستشفى فوجيان لصحة الأمومة والطفل (2022-NHP-04 إلى Zhifei Fu). نشكر Linying Zhou و Minxia Wu و Xi Lin و Yan Hu في مركز خدمة التكنولوجيا العامة بجامعة فوجيان الطبية على الدعم في إعداد عينات EM والتصوير الكهرومغناطيسي.
0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
Acetone | SCR | 10000418 | |
Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
Coverglass | Warner | 64-0715 | |
DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
Ethanol | SCR | 10009218 | |
Fiji image J | National Institutes of Health | ||
Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
Formvar | Sigma | 9823 | |
Glycerol | SCR | 10010618 | |
Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
Scalpel blades | Merck | S2771 | |
Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |