Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie
Summary
We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.
Abstract
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een uitgebreide microscopie die de lokalisatie-informatie combineert die wordt geleverd door fluorescentiemicroscopie (FM) en de context van cellulaire ultrastructuur verkregen door elektronenmicroscopie (EM). CLEM is een afweging tussen fluorescentie en ultrastructuur, en meestal brengt ultrastructuur de fluorescentie in gevaar. Vergeleken met andere hydrofiele inbeddingsharsen, zoals glycidylmethacrylaat, HM20 of K4M, is Epon superieur in ultrastructuurbehoud en sectie-eigenschappen. Eerder hadden we aangetoond dat mEosEM osmiumtetroxidefixatie en Epon-inbedding kan overleven. Met behulp van mEosEM hebben we voor het eerst bereikt dat Epon post embedding CLEM gebruikt, dat tegelijkertijd de fluorescentie en de ultrastructuur in stand houdt. Hier geven we stapsgewijze details over de voorbereiding van het EM-monster, de FM-beeldvorming, de EM-beeldvorming en de beelduitlijning. We verbeteren ook de procedures voor het identificeren van dezelfde cel die door FM-beeldvorming wordt afgebeeld tijdens de EM-beeldvorming en detailleren de registratie tussen de FM- en EM-beelden. Wij geloven dat men gemakkelijk kan bereiken met Epon na het inbedden van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie volgens dit nieuwe protocol in traditionele EM-faciliteiten.
Introduction
Fluorescentiemicroscopie (FM) kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van het doeleiwit te verkrijgen. De context rond het doeleiwit gaat echter verloren, wat cruciaal is om het doeleiwit grondig te onderzoeken. Elektronenmicroscopie (EM) heeft de hoogste beeldresolutie en biedt verschillende subcellulaire details. Desalniettemin ontbreekt het EM aan doeletikettering. Door het fluorescentiebeeld dat door FM is gemaakt nauwkeurig samen te voegen met het grijze beeld dat door EM is verkregen, kunnen correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) de informatie combineren die wordt verkregen door deze twee beeldvormingsmodi 1,2,3,4.
CLEM is een afweging tussen fluorescentie en de ultrastructuur1. Vanwege de beperkingen van de huidige fluorescerende eiwitten en de traditionele EM-monstervoorbereidingsprocedures, met name het gebruik van osmisch zuur (OsO4) en hydrofobe harsen zoals Epon, brengt de ultrastructuur altijd fluorescentie5 in gevaar. OsO4 is een onmisbaar reagens bij de voorbereiding van EM-monsters, dat wordt gebruikt om het contrast van EM-beelden te verbeteren. Vergeleken met andere inbeddingsharsen is Epon superieur in ultrastructuurconservering en sectie-eigenschappen5. Er zijn echter geen fluorescerende eiwitten die het fluorescentiesignaal kunnen vasthouden na de behandeling van OsO4 en Epon inbedding6. Om de beperkingen van fluorescerende eiwitten te overwinnen, werd pre-embedding CLEM ontwikkeld, waarbij FM-beeldvorming wordt gedaan vóór de voorbereiding van EM-monsters6. Het nadeel van het vooraf inbedden van CLEM is echter de onnauwkeurige registratie tussen de FM- en de EM-beelden5.
Integendeel, de CLEM-methode na inbedding voert de FM-beeldvorming uit na de voorbereiding van het EM-monster, waarvan de registratienauwkeurigheid 6-7 nm 5,6 kan bereiken. Om de fluorescentie van fluorescerende eiwitten te behouden, zijn zeer lage concentraties OsO4 (0,001%)3 of de hogedruk bevroren (HPF) en vriessubstitutie (FS) EM-bereidingsmethoden 4,7 gebruikt ten koste van de aangetaste ultrastructuur of het contrast van het EM-beeld. De ontwikkeling van mEos4b bevordert de voortgang van CLEM na inbedding aanzienlijk, hoewel glycidylmethacrylaat wordt gebruikt als inbeddingshars5. Met de ontwikkeling van mEosEM, dat de OsO4-kleuring en Epon-inbedding kan overleven, werd voor het eerst Epon post-inbedding met superresolutie CLEM bereikt, waarbij de fluorescentie en ultrastructuur tegelijkertijd behoudenbleven 6. Na mEosEM zijn verschillende fluorescerende eiwitten ontwikkeld die de OsO4-kleuring en de Epon-inbedding kunnen overleven 8,9,10,11. Dit bevordert de ontwikkeling van CLEM enorm.
Er zijn drie belangrijke aspecten aan Epon na de inbedding van CLEM. De eerste is het fluorescerende eiwit, dat het fluorescerende signaal moet behouden na de voorbereiding van het EM-monster. Volgens onze ervaring is mScarlet superieur aan andere gerapporteerde fluorescerende eiwitten. De tweede is hoe je dezelfde cel kunt vinden die is afgebeeld door FM-beeldvorming in EM-beeldvorming. Om dit probleem op te lossen, verbeteren we de procedure voor deze stap, zodat men gemakkelijk de beoogde cel kan vinden. De laatste is de methode om het FM-beeld uit te lijnen met het EM-beeld. Hier beschrijven we de registratie tussen de FM- en de EM-beelden. In dit protocol brengen we mScarlet tot expressie in VGLUT2-neuronen en tonen we aan dat mScarlet zich kan richten op secundaire lysosomen met behulp van Epon post-embedding CLEM. We bieden stap-voor-stap details voor Epon post-embedding CLEM, zonder afbreuk te doen aan de fluorescentie en de ultrastructuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is een veelzijdige beeldvormingsmethode, die de lokalisatie-informatie van het doeleiwit uit lichtmicroscopie (LM) en de context rond het doeleiwit uit elektronenmicroscopie (EM)6 kan combineren. Met de beperkingen van de huidige fluorescerende eiwitten is de veelgebruikte methode pre-inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), wat betekent dat de LM-beeldvorming wordt gedaan vóór de voorbereiding van het EM-monster. Bijna alle bestaande fl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32201235 aan Zhifei Fu), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2022J01287 aan Zhifei Fu), de Research Foundation for Advanced Talents aan de Fujian Medical University, China (XRCZX2021013 aan Zhifei Fu), de Finance Special Science Foundation van de provincie Fujian, China (22SCZZX002 aan Zhifei Fu), Oprichting van NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, en Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 tot Zhifei Fu). We danken Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin en Yan Hu van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor hun ondersteuning bij de voorbereiding van EM-monsters en EM-beeldvorming.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referenzen
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
