Epon Post Embedding Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie
Summary
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.
Abstract
Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist eine umfassende Mikroskopie, die die Lokalisierungsinformationen der Fluoreszenzmikroskopie (FM) und den Kontext der zellulären Ultrastruktur kombiniert, der durch die Elektronenmikroskopie (EM) erfasst wurde. CLEM ist ein Kompromiss zwischen Fluoreszenz und Ultrastruktur, und normalerweise beeinträchtigt die Ultrastruktur die Fluoreszenz. Im Vergleich zu anderen hydrophilen Einbettharzen wie Glycidylmethacrylat, HM20 oder K4M ist Epon in Bezug auf die Ultrastrukturkonservierung und die Trenneigenschaften überlegen. Zuvor hatten wir gezeigt, dass mEosEM die Fixierung von Osmiumtetroxid und die Epon-Einbettung überleben kann. Mit mEosEM haben wir zum ersten Mal ein Epon-Post-Embedding-CLEM erreicht, das die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig beibehält. Hier geben wir Schritt für Schritt Details über die EM-Probenvorbereitung, die FM-Bildgebung, die EM-Bildgebung und die Bildausrichtung. Wir verbessern auch die Verfahren zur Identifizierung derselben Zelle, die durch FM-Bildgebung während der EM-Bildgebung abgebildet wurde, und beschreiben die Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern. Wir glauben, dass man die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon nach diesem neuen Protokoll in traditionellen EM-Einrichtungen leicht erreichen kann.
Introduction
Die Fluoreszenzmikroskopie (FM) kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung des Zielproteins zu erhalten. Der Kontext, der das Zielprotein umgibt, geht jedoch verloren, was für eine gründliche Untersuchung des Zielproteins entscheidend ist. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat die höchste Bildauflösung und liefert mehrere subzelluläre Details. Dennoch fehlt es EM an einer Zielkennzeichnung. Durch die genaue Zusammenführung des von FM aufgenommenen Fluoreszenzbildes mit dem von EM aufgenommenen Graubild kann die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) die von diesen beiden Bildgebungsmodi erhaltenen Informationen kombinieren 1,2,3,4.
CLEM ist ein Kompromiss zwischen Fluoreszenz und der Ultrastruktur1. Aufgrund der Einschränkungen der derzeitigen fluoreszierenden Proteine und der traditionellen EM-Probenvorbereitungsverfahren, insbesondere der Verwendung von Osmisäure (OsO 4) und hydrophoben Harzen wie Epon, beeinträchtigt die Ultrastruktur immer die Fluoreszenz5. OsO4 ist ein unverzichtbares Reagenz in der EM-Probenvorbereitung, das zur Verbesserung des Kontrasts von EM-Bildern eingesetzt wird. Im Vergleich zu anderen Einbettungsharzen ist Epon in Bezug auf die Ultrastrukturkonservierung und die Trenneigenschaftenüberlegen 5. Allerdings können keine fluoreszierenden Proteine das Fluoreszenzsignal nach der Behandlung von OsO4 und Epon-Einbettung6 speichern. Um die Einschränkungen fluoreszierender Proteine zu überwinden, wurde ein Pre-Embedding-CLEM entwickelt, bei dem die FM-Bildgebung vor der EM-Probenvorbereitung durchgeführt wird6. Der Nachteil der Voreinbettung von CLEM ist jedoch die ungenaue Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern5.
Im Gegensatz dazu führt die CLEM-Methode nach dem Einbetten die FM-Bildgebung nach der EM-Probenvorbereitung durch, deren Registrierungsgenauigkeit 6-7 nm erreichen kann 5,6. Um die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine zu erhalten, wurden sehr niedrige Konzentrationen von OsO4 (0,001%)3 oder die Hochdruck-Gefrier- (HPF) und Gefriersubstitutions- (FS) EM-Präparationsmethoden 4,7 auf Kosten der beeinträchtigten Ultrastruktur oder des Kontrasts des EM-Bildes verwendet. Die Entwicklung von mEos4b fördert den Fortschritt von CLEM nach der Einbettung erheblich, obwohl Glycidylmethacrylat als Einbettharzverwendet wird 5. Mit der Entwicklung von mEosEM, dasdie OsO4-Färbung und Epon-Einbettung überleben kann, wurde zum ersten Mal eine superauflösende EPON-Post-Embedding-CLEM erreicht, bei der die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig erhaltenbleiben 6. Nach mEosEM wurden mehrere fluoreszierende Proteine entwickelt, die dieOsO4-Färbung und die Epon-Einbettung überleben können 8,9,10,11. Dies fördert die Entwicklung von CLEM erheblich.
Es gibt drei Schlüsselaspekte für Epon nach der Einbettung von CLEM. Das erste ist das fluoreszierende Protein, das das Fluoreszenzsignal nach der EM-Probenvorbereitung aufrechterhalten soll. Nach unserer Erfahrung ist mScarlet anderen fluoreszierenden Proteinen überlegen. Die zweite ist, wie man dieselbe Zelle findet, die durch FM-Bildgebung in der EM-Bildgebung abgebildet wurde. Um dieses Problem zu lösen, verbessern wir das Verfahren für diesen Schritt, so dass man die Zielzelle leicht finden kann. Die letzte ist die Methode zum Ausrichten des FM-Bildes am EM-Bild. Hier beschreiben wir die Registrierung zwischen den FM- und EM-Bildern. In diesem Protokoll exprimieren wir mScarlet in VGLUT2-Neuronen und zeigen, dass mScarlet sekundäre Lysosomen mit Hilfe von Epon nach der Einbettung von CLEM angreifen kann. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Details für Epon nach der Einbettung von CLEM, ohne die Fluoreszenz und die Ultrastruktur zu beeinträchtigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll ist ein vielseitiges bildgebendes Verfahren, das die Lokalisierungsinformationen des Zielproteins aus der Lichtmikroskopie (LM) und den Kontext um das Zielprotein aus der Elektronenmikroskopie (EM) kombinieren kann6. Aufgrund der Einschränkungen der derzeitigen fluoreszierenden Proteine ist die weit verbreitete Methode die Voreinbettung der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), was bedeutet, dass die LM-Bildgebung vor der EM-Probenvorbereitung durch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32201235 zu Zhifei Fu), der Natural Science Foundation der Provinz Fujian, China (2022J01287 zu Zhifei Fu), der Research Foundation for Advanced Talents an der Fujian Medical University, China (XRCZX2021013 zu Zhifei Fu), der Finance Special Science Foundation der Provinz Fujian, China (22SCZZX002 zu Zhifei Fu), Gründung des NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-Human Primate und des Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 an Zhifei Fu). Wir danken Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin und Yan Hu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die Unterstützung bei der EM-Probenvorbereitung und EM-Bildgebung.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referenzen
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
