Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon
Summary
Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.
Abstract
La microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) es una microscopía integral que combina la información de localización proporcionada por la microscopía de fluorescencia (FM) y el contexto de la ultraestructura celular adquirida por la microscopía electrónica (EM). CLEM es un compromiso entre fluorescencia y ultraestructura y, por lo general, la ultraestructura compromete la fluorescencia. En comparación con otras resinas de inclusión hidrofílicas, como el metacrilato de glicidilo, HM20 o K4M, Epon es superior en propiedades de conservación y seccionamiento de la ultraestructura. Anteriormente, habíamos demostrado que mEosEM puede sobrevivir a la fijación de tetróxido de osmio y a la inclusión de Epon. Usando mEosEM, logramos, por primera vez, Epon post embeding CLEM, que mantiene la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Aquí, proporcionamos detalles paso a paso sobre la preparación de la muestra EM, las imágenes FM, las imágenes EM y la alineación de la imagen. También mejoramos los procedimientos para identificar la misma célula fotografiada por imágenes FM durante la imagen EM y detallamos el registro entre las imágenes FM y EM. Creemos que se puede lograr fácilmente la microscopía electrónica y de luz correlativa posterior a la inclusión de Epon siguiendo este nuevo protocolo en instalaciones EM tradicionales.
Introduction
La microscopía de fluorescencia (FM) se puede utilizar para obtener la localización y distribución de la proteína diana. Sin embargo, se pierde el contexto que rodea a la proteína diana, lo cual es crucial para investigar a fondo la proteína diana. La microscopía electrónica (EM) tiene la resolución de imagen más alta y proporciona varios detalles subcelulares. Sin embargo, EM carece de etiquetado de objetivos. Al fusionar con precisión la imagen de fluorescencia tomada por FM con la imagen gris adquirida por EM, la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) puede combinar la información obtenida por estos dos modos de imagen 1,2,3,4.
CLEM es un compromiso entre la fluorescencia y la ultraestructura1. Debido a las limitaciones de las proteínas fluorescentes actuales y a los procedimientos tradicionales de preparación de muestras EM, especialmente el uso de ácido ósmico (OsO4) y resinas hidrofóbicas como el Epon, la ultraestructura siempre compromete la fluorescencia5. OsO4 es un reactivo indispensable en la preparación de muestras EM, que se utiliza para mejorar el contraste de las imágenes EM. En comparación con otras resinas de incrustación, Epon es superior en propiedades de conservación y seccionamiento de la ultraestructura5. Sin embargo, ninguna proteína fluorescente puede retener la señal de fluorescencia después del tratamiento de OsO4 y Epon embedding6. Para superar las limitaciones de las proteínas fluorescentes, se desarrolló el CLEM de pre-inclusión, en el que se realizan imágenes de FM antes de la preparación de la muestra EM6. Sin embargo, el inconveniente de la preincrustación de CLEM es el registro impreciso entre las imágenes FM y EM5.
Por el contrario, el método CLEM posterior a la inclusión realiza la obtención de imágenes FM después de la preparación de la muestra EM, cuya precisión de registro puede alcanzar los 6-7 nm 5,6. Para retener la fluorescencia de las proteínas fluorescentes, se han utilizado concentraciones muy bajas de OsO4 (0,001%)3 o los métodos de preparación de EM congelados a alta presión (HPF) y de sustitución por congelación (FS) 4,7 a expensas de la ultraestructura comprometida o del contraste de la imagen EM. El desarrollo de mEos4b promueve en gran medida el progreso del CLEM posterior a la inclusión, aunque el metacrilato de glicidil se utiliza como resina de inclusión5. Con el desarrollo de mEosEM, que puede sobrevivir a la tinción de OsO4 y a la inclusión de Epon, se logró por primera vez el CLEM de superresolución posterior a la incrustación de Epon, manteniendo la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente6. Después de mEosEM, se desarrollaron varias proteínas fluorescentes que pueden sobrevivir a la tinción de OsO4 y a la inclusión de Epon 8,9,10,11. Esto promueve en gran medida el desarrollo de CLEM.
Hay tres aspectos clave en el CLEM posterior a la incrustación de Epon. La primera es la proteína fluorescente, que debe mantener la señal fluorescente después de la preparación de la muestra EM. De acuerdo con nuestra experiencia, mScarlet es superior a otras proteínas fluorescentes reportadas. La segunda es cómo encontrar la misma célula de la que se obtienen imágenes de FM en imágenes de EM. Para resolver este problema, mejoramos el procedimiento para este paso para que uno pueda encontrar fácilmente la célula objetivo. El último es el método para alinear la imagen FM con la imagen EM. A continuación, detallamos el registro entre las imágenes FM y EM. En este protocolo, expresamos mScarlet en neuronas VGLUT2 y demostramos que mScarlet puede dirigirse a los lisosomas secundarios utilizando Epon post-inclusión de CLEM. Proporcionamos detalles paso a paso para el CLEM posterior a la inclusión de Epon, sin comprometer la fluorescencia y la ultraestructura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que aquí se presenta es un método de imagen versátil, que puede combinar la información de localización de la proteína diana de la microscopía óptica (LM) y el contexto que rodea a la proteína diana de la microscopía electrónica (EM)6. Con las limitaciones de las proteínas fluorescentes actuales, el método ampliamente utilizado es la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM), lo que significa que la imagen de LM se realiza antes de la preparación de la muestr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32201235 a Zhifei Fu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2022J01287 a Zhifei Fu), la Fundación de Investigación para Talentos Avanzados de la Universidad Médica de Fujian, China (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), la Fundación de Ciencias Especiales de Finanzas de la Provincia de Fujian, China (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fundación del NHC, Laboratorio Clave de Evaluación Técnica de la Regulación de la Fertilidad para Primates No Humanos y Hospital de Salud Materno-Infantil de Fujian (2022-NHP-04 a Zhifei Fu). Agradecemos a Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin y Yan Hu del Centro de Servicios Públicos de Tecnología de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo en la preparación de muestras de EM y la obtención de imágenes de EM.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Referenzen
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
