Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تقييم الفحص عالي الإنتاجية لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE)

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66238
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) باستخدام ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) كمسبار صبغة مضان باستخدام نهج فحص عالي الإنتاجية. يصف البروتوكول طرق التقييم الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الثلاثة المختلفة.

Abstract

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورا رئيسيا في تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي في العمليات الفسيولوجية والمرضية. يلعب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الفسيولوجية دورا مركزيا في التعديل المكاني والزماني للوظائف الخلوية الطبيعية مثل الانتشار والإشارات وموت الخلايا المبرمج والشيخوخة. في المقابل ، فإن الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المزمن مسؤول عن مجموعة واسعة من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وغيرها. وبالتالي فإن قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار أمر ضروري لفهم الوظائف الخلوية الطبيعية. تعد الطرق القائمة على التصوير الفلوري لتوصيف أنواع أنواع أنواع ROS داخل الخلايا نهجا شائعا. تستخدم العديد من بروتوكولات ROS التصويرية في الأدبيات صبغة 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). ومع ذلك ، فإن هذه الصبغة تعاني من قيود كبيرة في استخدامها وتفسيرها. يوضح البروتوكول الحالي استخدام مسبار الفلورسنت ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE) كطريقة بديلة لتحديد إجمالي إنتاج ROS في بيئة عالية الإنتاجية. تم استخدام منصة التصوير عالية الإنتاجية ، CX7 Cellomics ، لقياس وقياس إنتاج ROS. أجريت هذه الدراسة في ثلاثة خطوط خلايا سرطانية كبدية - HepG2 و JHH4 و HUH-7. يوفر هذا البروتوكول وصفا متعمقا للإجراءات المختلفة التي ينطوي عليها تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، بما في ذلك - تحضير محلول DHE ، وحضانة الخلايا بمحلول DHE ، وقياس شدة DHE اللازمة لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يوضح هذا البروتوكول أن صبغة الفلورسنت DHE هي خيار قوي وقابل للتكرار لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. من المرجح أن تكون الأساليب عالية الإنتاجية لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة في مجموعة متنوعة من الدراسات ، مثل علم السموم وفحص الأدوية وبيولوجيا السرطان.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي مجموعة من الجذور الكيميائية التي تحدث بشكل طبيعي ، شديدة التفاعل ، وغير مستقرة زمنيا والتي تشكلت كجزء من التمثيل الغذائي الخلوي الطبيعي في الخلايا. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورا رئيسيا وأساسيا في تعديل العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الطبيعية التي تحدث في الخلايا 1,2. المصدر الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا هو من مسار سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) كجزء من دورة الطاقة الحيوية العادية. تشمل المصادر الإضافية المهمة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التفاعلات الأنزيمية مثل أوكسيديز NADPH الخلوي في الخلايا. يحدث استقلاب جزيئات الطعام (مثل الجلوكوز) عبر مسار الفسفرة التأكسدية في مصفوفة الميتوكوندريا. يعد المستوى الأساسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ضروريا لتنظيم عمليات إشارات الخلايا الفسيولوجية الطبيعية. من المعروف أن العديد من جزيئات البروتين الرئيسية التي تشكل جزءا من مسارات إشارات التمثيل الغذائي للجلوكوز (على سبيل المثال ، Akt و PTEN) تستجيب لمستويات ROS داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العديد من الإنزيمات داخل الخلايا مثل أوكسيديز الزانثين ، سينسيز أكسيد النيتريك ، ومكونات البيروكسيسومال كجزء من المسارات الأنزيمية الخلوية 1,2. على النقيض من المصادر الطبيعية لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فإن بعض العوامل البيئية ، مثل xenobiotics ، والعوامل المعدية ، والأشعة فوق البنفسجية ، والتلوث ، وتدخين السجائر ، والإشعاع ، تؤدي أيضا إلى الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تعد محركا رئيسيا للإجهاد التأكسدي داخل الخلايا 1,3. يمكن أن يتسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي المرتفع في تلف الجزيئات الحيوية الأصلية داخل الخلية ، مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي ، مما يسبب أمراضا مختلفة مثل السرطان والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والالتهابات المزمنة والاضطرابات التنكسية العصبية1،3،4. لذلك ، تعد القياسات الدقيقة لأنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية لفهم الآليات الخلوية المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الناجمة عن الإجهاد التأكسدي.

نظرا للجداول الزمنية القصيرة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والقضاء عليها داخل الخلايا ، تظل القياسات الكمية لمختلف جذور أنواع الأكسجين التفاعلية تمثل تحديا. تستخدم طرق مثل الرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR) 5 ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) ، والتصوير القائم على مسبار التألق لقياس مختلف أنواع ROS6 الخلوية. في حين أن طرقا مثل EPR و HPLC تسفر عن تقديرات دقيقة كميا ، فإن هذه الطرق تنطوي على تدمير التشكل المكاني الخلوي وعادة ما تكون في شكل قياسات عالمية ومجمعة للعينة. في المقابل ، تحتفظ الطرق القائمة على التصوير مثل الطرق القائمة على مسبار التألق بالتشكل الخلوي والسياق المكاني لجيل ROS. ومع ذلك ، فإن خصوصية مجسات التألق المختلفة لأنواع مختلفة من جذور ROS لم تكن راسخة 7,8. تتوفر العديد من مجسات الفلورسنت مثل ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) وثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH-DA) وثنائي هيدرورودامين (DHR) وثنائي ميثيل أنثراسين (DMA) و 2،7 ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH) و 1،3-ثنائي فينيل إيزوبنزوفيوران (DPBF) وميتوسوكس للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية تجاريا. في العقود الماضية ، DHE و MitoSox و DCFH-DA هي الأصباغ الفلورية شائعة الاستخدام لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا والأنسجة 8,9. DCFH-DA هي صبغة مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن H2O2 داخل الخلايا والإجهاد التأكسدي. على الرغم من شعبية DCFH-DA ، فقد أظهرت العديد من الدراسات السابقة أنه لا يمكن استخدامه بشكل موثوق لقياس H2O2 داخل الخلايا ومستويات ROS الأخرى8،9،10،11،12،13،14.

في المقابل ، يظهر مسبار الفلورسنت ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) استجابة محددة لجذر الأكسيد الفائق داخل الخلايا (O2-). في حين أن جذر الأكسيد الفائق هو واحد من العديد من أنواع أنواع ROS التي لوحظت في الخلايا ، إلا أنه جذري مهم يشارك في الحد من المعادن الانتقالية ، والتحويل إلى بيروكسي نترات ، وتشكيل هيدروبيروكسيدات ، من بين تأثيرات أخرى داخل الخلايا. DHE تمتص بسرعة من قبل الخلايا ولها انبعاث مضان في نطاق الطول الموجي الأحمر15. عند التفاعل مع جذر الأكسيد الفائق على وجه التحديد ، يشكل DHE منتجا فلوريا أحمر ، 2-هيدروكسي إيثيديوم (2-OH-E +). وبالتالي ، يمكن اعتبار DHE بمثابة مسبار محدد للكشف عن الأكسيد الفائق. ومع ذلك ، يمكن أن يخضع DHE أيضا للأكسدة غير المتخصصة مع ONOO- أو OH. ، H2O 2 ، والسيتوكروم c لتشكيل منتج مضان ثان ، ethidium E + ، والذي يمكن أن يتداخل مع مستويات 2-OH-E + المقاسة. ومع ذلك ، فإن منتجات 2-OH E + و E + هذه ، مجتمعة ، تمثل جزءا رئيسيا من إجمالي أنواع ROS الخلوية التي لوحظت داخل الخلية عند تلطيخها ب DHE. E + يقحم في الحمض النووي ، مما يعزز بشكل كبير مضان8،9،10،11،13،14،15،16. نظرا لأن أطياف التألق للإيثيديوم والإيثيديوم 2-هيدروكسي تختلف اختلافا طفيفا فقط ، يمكن اكتشاف غالبية مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية التي تظهر في خلية ثانوية لإنتاج الأكسيد الفائق وقياسها باستخدام منتجات مضان DHE. تم تحديد أنواع ROS هذه باستخدام إثارة الطول الموجي 480 نانومتر وانبعاث الطول الموجي 610 نانومتر15،16،17.

بالإضافة إلى اختيار مسبار محدد للكشف عن ROS الفلوري ، من المهم اختيار طريقة حساسة للكشف لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. وبالتالي ، فإن التقييم الدقيق لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا هو المفتاح لتحديد حالات توازن الأكسدة والاختزال المضطربة التي تحدث في الخلايا المريضة أو الخلايا التي تعرضت لضغوط بيئية مختلفة مثل الإشعاع والمركبات السمية والعوامل السامة للجينات18. نظرا لأن أنواع الأكسجين التفاعلية هي ظاهرة شائعة الحدوث في الخلايا المسؤولة عن تنظيم مجموعة متنوعة من أنشطة إشارات الخلايا ، فإن الطرق القوية للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية. لتمكين مثل هذا التقييم عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، يستخدم هذا البروتوكول منصة فحص عالية المحتوى (HCS) لقياس أنواع أنواع الأكسجين التفاعلية. يسمح البروتوكول الحالي بتحليل عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، وهو أمر بالغ الأهمية في العديد من دراسات السموم19. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير حل سهل ومتعدد الاستخدامات لاكتشاف وقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في خلايا سرطان الخلايا الكبدية الملتصقة. تستخدم الكواشف الكيميائية ل H2O2 و menadione كمحفزات ROS قوية لقياس المستويات النسبية لإنتاج ROS في بيئة خاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية. يمكن ضبط هذا البروتوكول لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة في ظل الظروف المناسبة ، حسب الضرورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية

  1. قم بزرع خلايا الاختبار (خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2 و HUH7 و JHH4) في صفيحة 96 بئرا بكثافة بذر تبلغ 10000 خلية / بئر في حجم بذر نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
    1. قبل زراعة خلايا HepG2 ، قم بتغطية 96 بئرا بالكولاجين من النوع الرابع (50 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب تصلب الكولاجين ، ضع محلول المخزون في الثلج وبعد ذلك ، ابدأ عملية التخفيف إلى التركيز المطلوب.
    2. بعد فترة حضانة 2 ساعة ، استنشق الكولاجين الزائد واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
  2. قم بزراعة الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco طوال الليل عند 37 درجة مئويةوتركيز CO 2 بنسبة 5٪ في حاضنة مرطبة.
  3. في اليوم التالي ، أو عند الوصول إلى التقاء 80٪ -90٪ ، أيهما أسبق ، عالج الخلايا ب H2O2 (غير معالج ، 250 ميكرومتر ، 500 ميكرومتر ، 750 ميكرومتر ، و 1000 ميكرومتر) وميناديون (غير معالج ، 25 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 75 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر) ، على التوالي لمدة 30 دقيقة للحث على الإجهاد التأكسدي التمثيلي.
  4. بدلا من ذلك ، اختر اختبار الخلايا بمادة الاختبار المرغوبة القادرة على إحداث الإجهاد التأكسدي داخل الخلايا.

2. إعداد محلول المخزون والمخفف لتلطيخ الخلايا DHE

  1. قم بإعداد محلول مخزون DHE (5 مجم / مل أو 15.9 مللي مول) عن طريق إذابة 5 مجم من DHE إلى 1 مل من DMSO.
  2. قم بتخفيف محلول مخزون DHE بالماء المقطر المزدوج المعقم إلى تركيز نهائي 100 ميكرومتر.
  3. لتجنب عملية التجميد والذوبان للصبغة (التي قد تلحق الضرر بخصائص التألق بمرور الوقت) ، قم بإعداد العديد من القسامات في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل بتركيز 100 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  4. لتحقيق تركيز عمل نهائي يبلغ 10 ميكرومتر ، استخدم حصة من تركيز 100 ميكرومتر DHE وقم بتخفيفه باستخدام وسائط DMEM الدافئة مسبقا.
    ملاحظة: يجب تحضير محلول العمل طازجا في يوم التجربة.
  5. دوامة محلول صبغة مضان العمل لمدة 5-10 ثانية لضمان الخلط السليم للصبغة.

3. عملية تلطيخ DHE

  1. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على الدواء أو مادة الاختبار من كل بئر واغسلها برفق مرة واحدة إما باستخدام 1x PBS أو DMEM.
    ملاحظة: عند تنفيذ خطوات الإضافة أو الغسيل في التجربة ، من الضروري تجنب الاتصال المباشر بين الخلايا والماصة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب PBS برفق على طول جوانب الآبار لتقليل أي ضرر ميكانيكي محتمل للخلايا. سيساعد التأكد من أن الماصة لا تلمس الخلايا مباشرة في الحفاظ على سلامة الخلية وصلاحيتها طوال مدة التجربة.
  2. أضف 100 ميكرولتر من وسائط DMEM التي تحتوي على 10 ميكرومتر DHE (محلول عمل) في كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على DHE واغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). يمكن إجراء ذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات لضمان التحول السريع.
  4. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر باستخدام صبغة التلوين النووي Hoechst 33342 لمدة 10 دقائق في RT.
  5. قم بإزالة محلول التلوين النووي Hoechst 33342 من البئر وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر.
    ملاحظة: للحصول على خلايا ثابتة ، اتبع نفس البروتوكول الخاص بالخلايا الحية ، مع خطوة إضافية واحدة تتمثل في إضافة 4٪ PFA لمدة 5 دقائق بعد العلاج وتلطيخ DHE. قم بإزالة محلول PFA واغسل الخلايا باستخدام 1x PBS. ثم احتضان الخلايا بصبغة التلوين النووي لمدة 10 دقائق.
  6. انقل اللوحة إلى منصة فحص المحتوى العالي أو الفحص المجهري الفلوري أو قارئ اللوحة للحصول على الصور في أسرع وقت ممكن.

4. الحصول على الصور وقياس الكثافة

  1. تحميل اللوحة
    1. افتح برنامج فحص المحتوى العالي (HCS) Cellomics CX7 للحصول على البيانات.
    2. قم بمعايرة منصة التصوير بعناية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة في وقت مبكر باستخدام اللوحة المحددة المكونة من 96 بئرا لاستخدامها لتجنب أي صور ضبابية أو ضبابية في البيانات.
      ملاحظة: قد يكون للألواح متعددة الآبار من بائعين مختلفين خصائص مادية مختلفة ويمكن أن تؤثر على جودة الصور النهائية التي تم الحصول عليها.
    3. بمجرد المعايرة ، احفظ معلمات النظام الخاصة بالعلامة التجارية للوحة في قاعدة بيانات الأداة وأعد استخدامها للحصول على البيانات في المستقبل.
    4. ضع اللوحة بعناية مع العينات المعدة على المرحلة الساخنة لنظام التصوير HCS. تأكد من وضع اللوحة بإحكام وفي الاتجاه الصحيح للتصوير على حامل الصفيحة الدقيقة (على سبيل المثال ، حدد موقع الملصق الذي يحمل علامة A1 على مرحلة القارئ ، ثم قم بتدوير الصفيحة الدقيقة بحيث يتطابق موقع البئر A1 مع الزاوية مع الملصق).
    5. اضغط برفق على الصفيحة الدقيقة للتأكد من استقرارها بشكل مسطح على المسرح. يمكن أن يؤدي التسوية غير المتساوية للوحة في نظام HCS إلى أخطاء في الحصول على الصور.
    6. بعد وضع اللوحة في مكانها ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl ، ثم انقر فوق Ctrl-OK في مربع حوار تحميل / تفريغ اللوحة في البرنامج.
  2. اختيار معلمات التصوير
    1. في نظام التصوير HCS ، افتح وضع التنشيط المستهدف في واجهة التطبيقات الحيوية Cellomics وقم بإنشاء بروتوكول جديد باستخدام بروتوكول الإعداد ثنائي القناة المتوافق مع (أ) التلوين النووي و (ب) الحصول على بيانات مسبار DHE الفلوري. في البروتوكول الحالي ، تم استخدام المرشحات 386_BGSRS_BGSRS و 480_BGS_RS و 386_BGS_RS من أجل (أ) Hoechst 33342 للتلطيخ النووي ، (ب) إجمالي إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، و (ج) الكشف الجذري عن الأكسيد الفائق ، على التوالي. كان اختيار هذه المرشحات مدفوعا بالتداخل المحدد لخصائص الانبعاث لكل أصباغ (DAPI و DHE) المستخدمة كجزء من هذا البروتوكول.
      ملاحظة: يشير اصطلاح تسمية المرشحات ، على سبيل المثال ، 386-23_BGRFRN_BGRFRN ، إلى إثارة العينة بضوء 386 نانومتر مع عرض نطاق 23 نانومتر ، متبوعا بمرشح ثنائي اللون يمر باللون الأزرق (B) والأخضر (G) والأحمر (R) والأحمر البعيد (FR) وضوء الأشعة تحت الحمراء (N) القريب من الأشعة تحت الحمراء (N) عند نطاقات طول موجي محددة ويشير 386_BGS_RS إلى مرشح الانبعاث الذي يمرر ضوء الطول الموجي للانبعاث BGS و RS بعد ثنائي اللون.
    2. حدد أهداف عملية الحصول على الصور داخل واجهة بروتوكول البرنامج، مثل التكبير 10x أو 20x، حسب الضرورة.
    3. اختر التكبير الموضوعي المناسب اعتمادا على المستوى المطلوب من تفاصيل التصوير والدقة اللازمة للتجربة. ومع ذلك ، يتم إصلاح قرار كل هدف. ستتطلب تفاصيل الدقة الأعلى تغيير الهدف على النظام الأساسي. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام هدف 20x ، 0.45 NA ، وهو جزء من منصة فحص المحتوى العالي المستخدمة في هذا البروتوكول.
      ملاحظة: يمثل الهدف 20x مقايضة جيدة بين تفاصيل دقة التصوير وسرعة الاستحواذ اللازمة لالتقاط تغييرات ROS بمرور الوقت. يمكن اختيار أهداف تكبير أعلى (على سبيل المثال ، 40X) ، ومع ذلك ، سيؤدي ذلك إلى زيادة أوقات الاستحواذ.
    4. حدد إعدادات التعريض الضوئي لكاميرا الحصول على الصور، مثل وقت التعرض للضوء، وتجميع الكاميرا، والفاصل الزمني لمكدس z، وفقا للمتطلبات المحددة للبروتوكول.
      ملاحظة: يختلف وقت التعرض (غالبا بالمللي ثانية) بناء على قوة الإشارة وحساسية الفلوروفورات المحددة المستخدمة. قد يختلف هذا أيضا قليلا من تجربة إلى أخرى بناء على تركيز الصبغة وجودة التلطيخ. في البروتوكول الحالي ، يتم إصلاح معلمات الاستحواذ على النحو التالي - الهدف٪ - 35٪ ، وضع الحصول على الصور - 1104 × 1104 (مع 2x2 binning) ، والهدف 20x ، 0.45 NA. يمكن تعيين هذه المعلمات وفقا للظروف التجريبية المحددة.
  3. معلمات تكوين التصوير
    ملاحظة: بمجرد ضبط معلمات التصوير، يمكن بدء عملية جمع الصور باستخدام واجهة البرنامج.
    1. معلمات جمع الصور
      1. تحديد كائن التتبع الأساسي محل الاهتمام (نواة الخلايا) باستخدام خوارزميات مختلفة متوفرة في الأداة (البصريات - isodata ، الثابتة ، والمثلث).
        ملاحظة: يتم استخدام طريقة isodata لتحديد وتمييز الكائن الأساسي في هذا البروتوكول.
      2. قسم الكائن (إن وجد) إما حسب الشكل أو معلمة الكثافة.
      3. تحقق من صحة الكائن الأساسي استنادا إلى معلمات الحجم والشكل والكثافة المطلوبة الفريدة لكل نوع خلية.
      4. بعد ذلك ، حدد "منطقة الاهتمام" (ROI) حول هذا الكائن الأساسي.
        ملاحظة: عائد الاستثمار هو معلمة رئيسية للحصول على البيانات التي تحدد الموقع الذي يتم فيه تحديد شدة الصبغة الفلورية لتكون متسقة وقابلة للتكرار عبر أنواع الخلايا. يحدد عائد الاستثمار المعلمات الرئيسية (مثل شدة الصبغة) ، والتي يتم قياسها لكل كائن تتبع أساسي (أي خلية) في قنوات مختلفة من الجهاز. يمكن تعريف عائد الاستثمار في شكل دائرة أو حلقة حول نواة كل خلية. يحصل برنامج HCS تلقائيا على شدة علامة صبغة DHE الفلورية في القناة 2 ضمن حدود عائد الاستثمار لكل خلية يتم تقسيمها وتحليلها بطريقة آلية.
      5. اضبط دائرة 20 ميكرومتر حول الكائن الأساسي (النواة). تم اختيار مسافة 20 ميكرومتر في هذه الدراسة بناء على الأحجام التقريبية لخطوط الخلايا المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول (HepG2 و JHH-4 و HUH-7). حصل عائد الاستثمار الحلقي البالغ 20 ميكرومتر حول الخلايا على شدة التألق بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.
        ملاحظة المعلمة الرئيسية في اختيار عائد الاستثمار هي القدرة على تغطية منطقة الخلية بشكل كاف ؛ يعتمد حجم عائد الاستثمار الدائري على حجم الخلية. قد تتطلب الخلايا الأكبر عائد استثمار أكبر والعكس صحيح للحصول على عائد استثمار أصغر. يجب تحديد هذه المعلمات في وقت مبكر لكل نوع خلية وصبغة مضان ذات أهمية.
  4. توصيف السكان وتحديد المعالم المراد تخزينها
    1. بمجرد تحديد معلمات الاستحواذ المختلفة في بروتوكول التصوير HCS ، اضبط نظام HCS في وضع الحصول على البيانات.
    2. تم تعيين معلمات الحصول على الصور لهذا البروتوكول على النحو التالي: حد مسح يبلغ 1000 خلية / بئر ، مع حد أدنى لمتطلبات 10 كائنات (خلايا) لكل حقل.
      ملاحظة: تم تحديد عدد الحقول التي تم تقييمها لكل بئر بناء على عدد الخلايا النهائي الذي يصل إلى الرقم 1000. يستمر نظام HCS في البحث في مواقع مختلفة داخل البئر حتى يحصل على السكان المستهدفين البالغ 1000 خلية / بئر. وبالتالي تعتمد سرعة الاستحواذ على التقاء وإجمالي عدد الخلايا الموجودة في كل بئر من لوحة 96 بئرا. في البروتوكول الحالي ، تم جمع الكثافة الكلية والمتوسطة للقناة 2 (التي تمثل جذور الأكسيد الفائق وإجمالي إنتاج ROS) من كل بئر لمزيد من التحليلات النهائية.
  5. التقاط الصور ومعالجتها وتحليلها
    1. بعد ضبط معلمات الحصول على الصور وإنهائها ، ابدأ عملية المسح لكل لوحة 96 بئرا.
      ملاحظة: يتيح نظام التصوير Cellomics CX7 فحص المحتوى العالي والتحليل الآلي لعينات من مجموعة متنوعة من المعلمات ، بما في ذلك إنتاج ROS داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. بالإضافة إلى إنتاج ROS ، فإن نظام HCS قادر على توفير معلومات قيمة إضافية حول المعلمات المختلفة مثل مورفولوجيا الخلية ، والتوطين تحت الخلوي ، والعديد من الميزات الخلوية الأخرى ذات الأهمية. بمجرد تحسينها للاستحواذ ، تسمح منصة التصوير HCS بالتوصيف الشامل والنوعي والكمي لمعلمات الخلية بطريقة قوية.
    2. بعد اكتمال عملية المسح ، قم بتشغيل برنامج View Analysis وقم بتصدير معلمات البيانات الكمية المختلفة بتنسيق .csv لإجراء تحليل إضافي.
    3. باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية ، انسخ والصق القيم الكمية المختلفة ذات الأهمية لإجراء تحليلات إضافية في المراحل النهائية.
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي ، تم استخدام برنامج GraphPad Prism لتحليل قيم شدة DHE استجابة للإجهاد التأكسدي المستحث بسبب التعرض H2O2 و menadione.
  6. البيانات والتحليل الإحصائي
    1. احسب متوسط شدة القناة 2 (يمثل إجمالي قيم ROS وجذور الأكسيد الفائق).
      ملاحظة: تم تكرار جميع التجارب لحساب قيم الشدة ثلاث مرات مع 6 مكررات لكل حالة في كل مستوى جرعات.
    2. قم بإجراء اختبار ANOVA أو t أحادي الاتجاه لقياس الاختلافات في قيم الشدة بين ظروف الاختبار المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عبارة عن صبغة مضان فائقة الاستجابة للأكسيد توفر معلومات محددة فيما يتعلق بحالات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. دتنبعث صبغة ال HEE جوهريا من مضان أزرق في السيتوبلازم. ومع ذلك ، عند التفاعل مع جذور الأكسيد الفائق ، يتم تحويله إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم ، والذي ينبعث منه مضان في الأطوال الموجية الحمراء (>550 نانومتر) (الشكل 1). دتنتقل صبغة ال EHE بسهولة إلى الخلايا والنواة. يمكن تصور التألق المنبعث باستخدام إعداد مجهر مضان متوفر بشكل شائع في العديد من المختبرات. في الدراسة الحالية ، تم اختبار فائدة صبغة DHE على خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية المتعددة - خلايا HUH7 و JHH4 و HepG2 كمسبار لتوليد أنواع ROS على منصة فحص عالية المحتوى. تمت معالجة الخلايا بعاملين مولدين لأنواع الأكسجين التفاعلية - (أ) بيروكسيد الهيدروجين و (ب) ميناديون لمدة 30 دقيقة بطريقة تعتمد على الجرعة (انظر الشكل 2 والشكل 3 للحصول على تفاصيل الجرعات) للحث على الإجهاد التأكسدي في الخلايا متبوعا بوضع علامات صبغة DHE في لوحة 96 بئرا. زاد كل من H2O2 و menadione من شدة التألق بشكل كبير في جميع خطوط الخلايا الثلاثة بطريقة تعتمد على الجرعة. باستخدام خوارزميات تجزئة الصورة والقياس الكمي داخل منصة الفحص عالية الإنتاجية ، تم تحديد شدة مضان DHE الناجم عن ROS في 1000 خلية لكل بئر عبر ست نسخ متماثلة. تم قياس ثلاث مكررات مستقلة ، وتم تجميع النتائج وتحليلها. تلعب صبغة Hoechst 33342 النووية دورا مهما في تحديد المستوى الذي توجد فيه الخلايا الملتصقة في كل بئر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اكتشاف مضان 2-OH-E + و E + في كل من النواة والسيتوبلازم للخلايا المختبرة ، على التوالي ، على منصة الفحص عالية الإنتاجية (انظر الشكل 4).

أدى التعرض ل H2O2 إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في التألق الناجم عن ROS عبر جميع خطوط الخلايا التي تم تحليلها بطريقة تعتمد على الجرعة (انظر الشكل 2 ؛ اللوحة السفلية). ومع ذلك ، لم يلاحظ مثل هذه الاستجابة المعتمدة على الجرعة في حالة التعرض للميناديون. مع ميناديون ، أظهر خط خلايا JHH4 زيادة تعتمد على الجرعة في شدة الفلورسنت ، بينما في خطوط خلايا HepG2 و HUH7 ، لوحظ اختلاف كبير في شدة التألق فقط عند تركيزات الميناديون الأعلى (انظر الشكل 3 ؛ اللوحة السفلية). يمكن أن تكون هذه الاختلافات في استجابات توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بسبب الآليات المتميزة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ل H2O2 و menadione. في حين أن H2O2 يؤدي إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا بطريقة أكثر مباشرة (على سبيل المثال ، من خلال عمل الإنزيمات المضادة للأكسدة مثل البيروكسيديز والكاتالاسيس) ، يفترض أن الميناديون يولد أنواع ROS بطريقة غير مباشرة من خلال خلل الميتوكوندريا المستحث. نظرا للآلية غير المباشرة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، قد يتطلب مضان DHE مزيدا من الوقت للظهور مع menadione. تشير هذه النتائج إلى أن مضان DHE المعتمد على ROS حساس لمدة التعرض للإجهاد التأكسدي والتركيز وأنواع الخلايا. وبالتالي فإن تحسين البروتوكول التجريبي لكل نوع فريد من الخلايا أمر لا بد منه. والأهم من ذلك ، يوضح هذا البروتوكول جدوى استخدام صبغة DHE كعامل للكشف عن ROS بطريقة عالية الإنتاجية ، والتي تستخدم في مجالات مثل علم السموم وبيولوجيا السرطان وفحص الأدوية.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي يوضح مسارات التحويل التأكسدي لجزيء مضان DHE إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم (2-OH-E +) وإيثيديوم (E +) على التوالي. تتداخل أطياف الانبعاث الفلوري 2-OH-E + و E + عند إثارة 480 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: يزيد علاج بيروكسيد الهيدروجين من مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة. خلايا سرطان الخلايا الكبدية - (A) HUH7 و (B) JHH4 و (C) HepG2 ب H2O2 بجرعات 250 ميكرومتر و 500 ميكرومتر و 750 ميكرومتر و 1000 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. تم تلطيخ الخلايا بصبغة DHE (10 ميكرومتر) في وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة إضافية ، تليها تلطيخ Hoechst 33342 النووي. تم إحصاء ما مجموعه 1000 خلية في كل بئر. لوحظت زيادة خطية تعتمد على الجرعة في مضان DHE عبر جميع خطوط الخلايا الثلاثة (اللوحة العلوية). لوحظت زيادات ذات دلالة إحصائية في التألق في جميع خطوط الخلايا لجرعات 500 ميكرومتر وما فوق (اللوحة السفلية). كل مجموعة بيانات هي في المتوسط ستة مكررات في لوحة 96 بئرا تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3). تمت مقارنة ظروف العلاج بالعينات غير المعالجة باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (**** - p < 0.0001 ، *** - p < 0.001 ؛ شريط مقياس الصورة - 50 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يزيد علاج Menadione من مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة. خلايا سرطان الخلايا الكبدية - (A) HUH7 و (B) JHH4 و (C) HepG2 عولجت بالميناديون بجرعات 25 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 75 ميكرومتر و 100 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. تم تلطيخ الخلايا بصبغة DHE (10 ميكرومتر) في وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة إضافية ، تليها تلطيخ Hoechst 33342 النووي. تم إحصاء ما مجموعه 1000 خلية في كل بئر. لوحظت زيادة خطية تعتمد على الجرعة في مضان DHE عبر جميع خطوط الخلايا الثلاثة (اللوحة العلوية). لوحظت زيادات ذات دلالة إحصائية في التألق باستمرار للجرعة القصوى (100 ميكرومتر ؛ اللوحة السفلية). لوحظ التباين للجرعات المتبقية من ميناديون عبر خطوط الخلايا المختلفة (JHH4 > HUH7 > HepG2). كل مجموعة بيانات هي في المتوسط ستة مكررات في لوحة 96 بئرا تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3). تمت مقارنة ظروف العلاج بالعينات غير المعالجة باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (**** - p < 0.0001 ، *** - p < 0.001 ؛ شريط مقياس الصورة - 50 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مضان DHE أحادي الخلية - منظر عن قرب للتغيرات الفلورية DHE التي لوحظت بعد العلاج ب (A) بيروكسيد الهيدروجين و (B) menadione لمدة 30 دقيقة. لوحظت التغيرات السيتوبلازمية والنووية لفلورة DHE في الخلايا المختلفة. ينظر أيضا إلى قناع التجزئة التلقائي الناتج عن منصة فحص المحتوى العالي. شريط مقياس الصورة - 10 ميكرومتر. التكبير - 20x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: تصوير مضان DHE المدفوع بالأكسيد الفائق استجابة لبيروكسيد الهيدروجين. خلايا سرطان الخلايا الكبدية - (A) HUH7 و (B) JHH4 و (C) HepG2 ب H2O2 بجرعات 250 ميكرومتر و 500 ميكرومتر و 750 ميكرومتر و 1000 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. ثم تم تلطيخ الخلايا بصبغة DHE (10 ميكرومتر) في وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة إضافية. بعد ذلك ، تم إضاءة الخلايا ب 386 نانومتر LED ، وتم جمع التصوير الفلوري عند >560 نانومتر. لم يتم إجراء أي تلطيخ نووي مضاد لتجنب الحديث الطيفي. لوحظت زيادة تعتمد على الجرعة في مضان DHE عند جرعات > 500 ميكرومتر. من المتوقع أن يكون مضان DHE المضيء بالأشعة فوق البنفسجية بسبب غالبية إنتاج جذور الأكسيد الفائق. كل مجموعة بيانات هي في المتوسط ستة مكررات في لوحة 96 بئرا تم الحصول عليها من تجربتين مستقلتين (ن = 2). تمت مقارنة ظروف المعالجة بالعينات غير المعالجة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (**** - p < 0.0001 ، *** - p < 0.001 ؛ شريط مقياس الصورة - 50 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تصوير مضان DHE المدفوع بأكسيد فائق استجابة للميناديون - خلايا سرطان الخلايا الكبدية - (A) HUH7 و (B) JHH4 و (C) HepG2 عولجت بالميناديون بجرعات 25 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 75 ميكرومتر و 100 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. ثم تم تلطيخ الخلايا بصبغة DHE (10 ميكرومتر) في وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة إضافية. على غرار بيروكسيد الهيدروجين ، لوحظت زيادة تعتمد على الجرعة في مضان DHE. كل مجموعة بيانات هي في المتوسط ستة مكررات في لوحة 96 بئرا تم الحصول عليها من تجربتين مستقلتين (ن = 2). تمت مقارنة ظروف المعالجة بالعينات غير المعالجة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (**** - p < 0.0001 ، *** - p < 0.001 ؛ شريط مقياس الصورة - 50 ميكرومتر) الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) التي يحركها الأكسيد الفائق باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) على نظام فحص عالي المحتوى. تستخدم غالبية البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات DCFH-DA كمسبار تصوير مضان لتحديد أنواع ROS. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسات متعددة أن DCFH-DA ليس مسبارا مثاليا لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. تشمل الأسباب المختلفة المفترضة لعدم ملاءمة DCFH-DA كمسبار - (i) لا يظهر DCFH-DA تفاعلا مباشرا مع H2O2 ، مما يجعله صبغة غير مناسبة لتقييم مستوى H2O2 داخل الخلايا. (ii) العديد من الأنواع المؤكسدة ذات الإلكترون الواحد ، مثل OH. و NO2. و ONOO- ، تؤكسد DCFH إلى DCF. (iii) يمكن للمعادن الانتقالية والسيتوكروم ج وبيروكسيديز الهيم أن تعزز أكسدة DCFH في وجود الأكسجين و H2O2. (iv) الأهم من ذلك ، أن DCFH-DA تنتج المنتج الوسيط DCFH.- / DCF ، والذي ، في وجود الأكسجين ، يحفز إنتاج أكسيد فائق إضافي. يؤدي الاختلال باستخدام O2.- إلى توليد H2O2 إضافي ، مما قد يؤدي إلى زيادة مصطنعة في شدة التألق ومستويات ROS مرتفعة بشكل خاطئ. اعتبر العديد من المؤلفين استخدام DCFH-DA كمسبار فلوري غير موثوق به للكشف عن H2O2 داخل الخلايا وأنواع ROS الأخرى8،9،10،11،12،13،14.

على عكس DCFH-DA ، DHE يتفاعل بشكل خاص مع جذر الأكسيد الفائق ، مما يؤدي إلى توليد منتج فلوري ، 2-هيدروكسي إيثيديوم (2-OH E +). يمكن أن تتفاعل أنواع ROS غير الفائقة الأكسيد أيضا مع DHE لتوليد منتج فلوري ثان ، إيثيديوم (E +). في حين أن أطياف التألق ل 2-OH-E + و E + متشابهة نسبيا ، فإن هذين الجزيئين يمثلان المنتجات النهائية للتفاعلات المحددة بين أنواع ROS داخل الخلايا و DHE وهما مسؤولان عن شدة التألق الكلية التي لوحظت داخل الخلايا بسبب الإجهاد التأكسدي. أشارت بعض الدراسات إلى أن الإثارة الانتقائية عند أطوال موجية أقصر للأشعة فوق البنفسجية (<400 نانومتر) قد تكون أكثر تحديدا لإثارة الإيثيديوم 2-OH (على عكس E +) ، وبالتالي ، إنتاج جذور الأكسيد الفائق7،12،14. تم تقييم ذلك من خلال إثارة الخلايا بضوء LED 386 نانومتر وحده. بالنسبة إلى إثارة الطول الموجي 480 نانومتر ، لوحظ انخفاض شدة الانبعاث عند الطول الموجي 560 نانومتر (انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). ومع ذلك ، لا يمكن للمرء أن يكون متأكدا من أن هذا يرجع فقط إلى مضان 2-OH Ethidium وحده ويمثل عيبا محتملا في النهج الحالي. أظهرت دراسات أخرى أن إثارة الأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال ، 386 نانومتر) يمكن أن تؤدي أيضا إلى انبعاث مضان إيثيديوم متزامن ، وإن كان بمستويات أقل مقارنة بإيثيديوم 2-OH 7,15. بغض النظر ، فإن بروتوكولنا يؤسس DHE كبديل صبغة أفضل لقياس الاختلافات الكمية لغالبية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا باستخدام نظام تصوير وفحص عالي المحتوى.

يفترض أن عدم وجود محركات وسيطة لتوليد ROS (مثل تلك التي شوهدت في DCFH-DA) هي ميزة رئيسية في استخدام DHE لتقييم إنتاج ROS داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن آلية مضان DHE هذه لم يتم تأسيسها بشكل راسخ بعد. في الحالات التي يكون فيها القياس الكمي الدقيق لمستويات ROS ضروريا ، ينصح المرء باستخدام طرق متعامدة إضافية للتحقق الكمي مثل HPLC و / أو طرق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) لتقدير مستويات 2-OH-E + بدقة داخل الخلايا8،9،13. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يدرك أن طرق HPLC و LC-MS تتضمن بالضرورة تجميع الخلايا وإذابتها للتقييم. وبالتالي ، فإن المعلومات المكانية والزمانية المشفرة في طريقة التصوير القائمة على التألق كما هو الحال في البروتوكول الحالي ستفقد في HPLC و LC-MS وتمثل ميزة رئيسية لطرق تقييم ROS القائمة على التصوير. ميزة إضافية للتألق الأحمر المنقلب ل DHE هي أن ضوء الطول الموجي الأطول (باللون الأحمر) أقل سمية للخلايا بسبب انخفاض الطاقة التي يحملها الضوء الأحمر.

تم اختبار الطبيعة المعتمدة على الجرعة لفلورة DHE لقياس التغيرات النسبية داخل الخلايا ROS باستخدام menadione وبيروكسيد الهيدروجين كمحفزات الإجهاد التأكسدي. تم اختيار Menadione و Peroxide الهيدروجين كمواد اختبار بسبب الآليات المتغيرة ل ROS وتوليد الإجهاد التأكسدي20,21. في حين أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بسبب التعرض للميناديون غير مباشر (من خلال خلل الميتوكوندريا) ، فإن H2O2 ينتج إجهاد مؤكسد بطريقة أكثر مباشرة. أدت زيادة تركيزات الميناديون إلى تعزيز إنتاج مضان DHE بطريقة خطية وقابلة للتكرار وتعتمد على الجرعة. على غرار menadione ، H2O2 هو محفز معروف ل ROS قادر على توليد جذور الهيدروكسيل (OH.) من خلال كيمياء فنتون بطريقة مباشرة22. لوحظت استجابة خطية ومعتمدة على الجرعة بالمثل في مضان DHE بسبب التعرض ل H2O2. نظرا لانتقائية DHE لجذر الأكسيد الفائق على وجه التحديد ، فإنه لا يتفاعل مباشرة مع H2O2. بدلا من ذلك ، تتفاعل جذور الأكسيد الفائق داخل الخلايا المنتجة في البداية مع H2O2 لتشكيل أنواع ROS الثانوية ، مثل جذور الهيدروكسي عبر تفاعلات Haber-Weiss و Fenton ، والتي يتم اكتشافها بعد ذلك بواسطة DHE fluorescence23. تم إنشاء طيف انبعاث التألق ل DHE استجابة لمادتين مؤكسدة مختلفتين عن طريق قياس غالبية إنتاج ROS داخل الخلايا في البروتوكول الحالي 8,13. تحدد هذه النتائج فائدة صبغة DHE الفلورية كبديل أفضل للكشف عن مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا وتحديدها كميا باستخدام مناهج الفحص عالية الإنتاجية.

إن الانتقائية الفائقة والحساسية والخصائص البصرية ل DHE تجعلها بديلا قيما للتحقيق في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والضرر التأكسدي بطريقة عالية الإنتاجية ، كما هو محدد في البروتوكول الحالي. سوف تستكشف الدراسات المستقبلية في مختبرنا دور DHE كعلامة ROS في التفاعل المتبادل بين ROS وآليات الإشارات الخلوية في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة في بيئة عالية الإنتاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم RK و RRG بمنحة من مركز UNM للمعادن في علم الأحياء والطب (CMBM) من خلال منحة NIH NIGMS P20 GM130422. تم دعم RRG بجائزة تجريبية من منحة NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. تم توفير الدعم الأساسي للتصوير لأداة CX7 Cellomics من خلال نوى مركز AIM بتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121176. نود أن نشكر الدكتورة شارينا ديساي والدكتور لي تشن على مساعدتهما القيمة في القضايا الفنية المتعلقة باستخدام منصة التصوير CX7 Cellomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes  VWR  20170-038 
96- well plate  Corning Costar  07-200-90 
Cellomics Cx7 ThermoFisher  HCSDCX7LEDPRO
Collagen  Advanced Biomatrix   5056 
DHE (Dihydroethidium)  ThermoFisher  D1168 
DMEM  Sigma   6046 
FBS  VWR  97068-085 
GraphPad Prism GraphPad Version 6.0
HepG2 cell line ATCC
Hoechst  ThermoFisher  33342 
HUH7 cell line ATCC
Hydrogen Peroxide  Sigma  88597 
JHH4 cell line ATCC
Menadione  Sigma  M5625 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 203 ، أنواع الأكسجين التفاعلية ، ثنائي هيدرويثيديوم ، الفحص عالي الإنتاجية ، سرطان الكبد الصفراوي ، السكري ، علم السموم ، الأصباغ الفلورية
تقييم الفحص عالي الإنتاجية لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, R., Gullapalli, R. R. High… More

Kumar, R., Gullapalli, R. R. High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye. J. Vis. Exp. (203), e66238, doi:10.3791/66238 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter