Summary
このプロトコルはハイスループットのスクリーニングのアプローチを使用して蛍光性の染料の調査としてdihydroethidium (DHE)を使用して細胞内の活性酸素種(ROS)を量化する新しい方法を記述する。プロトコルは3つのhepatocellular癌腫のセルラインの細胞内の活性酸素種(ROS)の量的な査定のための方法を記述する。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、生理学的および病理学的プロセスにおける細胞代謝の調節において重要な役割を果たします。生理学的ROS産生は、増殖、シグナル伝達、アポトーシス、老化などの正常な細胞機能の空間的および時間的調節において中心的な役割を果たします。対照的に、慢性的なROSの過剰産生は、がん、心血管疾患、糖尿病など、幅広い疾患の原因となっています。したがって、正確で再現性のある方法でROSレベルを定量化することは、正常な細胞機能を理解するために不可欠です。細胞内のROS種を特徴付けるための蛍光イメージングベースの方法は、一般的なアプローチです。文献のイメージングROSプロトコルの多くは、2'-7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)色素を使用しています。しかし、この染料は、その使用法と解釈可能性に大きな制限があります。現在のプロトコルでは、ハイスループット設定で総ROS産生を定量化するための代替方法として、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光プローブの使用が実証されています。ハイスループットイメージングプラットフォームであるCX7 Cellomicsを使用して、ROS産生を測定および定量化しました。この研究は、HepG2、JHH4、およびHUH-7の3つの肝細胞がん細胞株で実施されました。このプロトコルはを含む細胞内のROSの評価にかかわるさまざまなプロシージャの詳細な記述を、含んでいる-DHEの解決の準備、DHEの解決が付いている細胞のインキュベーション、およびROSの生産を特徴付けるのに必要なDHEの強度の測定を提供する。このプロトコルは、DHE蛍光色素がハイスループット方式で細胞内ROS産生を特徴付けるための堅牢で再現性のある選択肢であることを示しています。ROS産生を測定するためのハイスループットアプローチは、毒物学、薬物スクリーニング、がん生物学など、さまざまな研究に役立つ可能性があります。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、細胞内の正常な細胞代謝の一部として形成される、天然に存在する反応性が高く、時間的に不安定な化学ラジカルのグループです。ROSは、細胞で発生する正常な生理学的および生化学的プロセスの調節において重要かつ不可欠な役割を果たします1,2。細胞内のROS産生の主な原因は、正常な生体エネルギーサイクルの一部としてのミトコンドリア電子伝達鎖(ETC)経路からのものです。ROS産生の重要な追加源には、細胞内の細胞NADPHオキシダーゼなどの酵素反応が含まれます。食物分子(グルコースなど)の代謝は、ミトコンドリアマトリックスの酸化的リン酸化経路を介して起こります。ROS産生のベースラインレベルは、正常な生理学的細胞シグナル伝達プロセスを調節するために不可欠です。グルコース代謝シグナル伝達経路の一部である多くの重要なタンパク質分子(AktやPTENなど)は、細胞内のROSレベルに応答することが知られています。さらに、活性酸素は、キサンチンオキシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、ペルオキシソーム成分などのさまざまな細胞内酵素によって、細胞酵素経路の一部として産生されます1,2。天然のROSの発生源とは対照的に、生体異物、感染性病原体、紫外線、汚染、喫煙、放射線などの特定の環境要因も、細胞内の酸化ストレスの主要な要因であるROSの過剰産生につながります1,3。細胞の酸化ストレスが高まると、脂質、タンパク質、DNAなどの細胞内の天然生体分子が損傷し、がん、糖尿病、心血管疾患、慢性炎症、神経変性疾患などのさまざまな疾患を引き起こす可能性があります1,3,4。したがって、酸化ストレス誘発性疾患の病態生理に関与する細胞メカニズムを理解するためには、ROSの正確な測定が不可欠です。
細胞内でのROSの産生と除去の時間スケールが短いため、さまざまなROSラジカルの定量測定は依然として課題です。電子常磁性共鳴(EPR)5、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、蛍光プローブベースのイメージングなどの方法を使用して、さまざまな細胞ROS6を測定します。ESRやHPLCなどの方法では定量的に正確な推定値が得られますが、これらの方法は細胞の空間形態の破壊を伴い、通常はサンプルの全体的およびバルク測定の形式になります。対照的に、蛍光プローブベースの方法などのイメージングベースの方法では、ROS生成の細胞形態と空間的コンテキストが保持されます。しかし、異なる種類のROSラジカルに対する様々な蛍光プローブの特異性は十分に確立されていない7,8。ジヒドロエチジウム(DHE)、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)、ジヒドロロダミン(DHR)、ジメチルアントラセン(DMA)、2,7ジクロロジヒドロフルレセイン(DCFH)、1,3-ジフェニルイソベンゾフラン(DPBF)、MitoSoxなどの蛍光プローブが市販されています。過去数十年にわたり、DHE、MitoSox、およびDCFH-DAは、細胞および組織内のROSを測定するために一般的に使用されている蛍光色素です8,9。DCFH−DAは、細胞内のH2O2および酸化ストレスを検出するために広く使用されている色素である。DCFH−DAの人気にもかかわらず、複数の先行研究は、細胞内H2O2および他のROSレベル8,9,10,11,12,13,14を測定するために確実に使用することができないことを示している。
対照的に、蛍光プローブジヒドロエチジウム(DHE)は、細胞内スーパーオキシドラジカル(O2-)に対して特異的な応答を示します。スーパーオキシドラジカルは、細胞内で観察される多くの活性酸素種の1つですが、遷移金属の還元、ペルオキシ硝酸塩への変換、ヒドロペルオキシドの形成などの細胞内効果に関与する重要なラジカルです。DHEは細胞に素早く取り込まれ、赤色の波長範囲15で蛍光を発します。特にスーパーオキシドラジカルと反応すると、DHEは赤色蛍光生成物である2-ヒドロキシエチジウム(2-OH-E+)を形成します。したがって、DHEはスーパーオキシド検出のための特異的なプローブと見なすことができます。しかしながら、DHEは、ONOO-またはOH.、H2O2、およびシトクロムcによる非特異的酸化を受けて、第2の蛍光生成物であるエチジウムE+を形成することもでき、これは測定された2-OH-E+レベルに干渉する可能性があります。しかし、これらの2-OH E+およびE+産物は、DHEで染色されたときに細胞内で観察される全細胞ROS種の大部分を占めています。E +はDNAにインターカレートし、その蛍光性を大幅に増強します8,9,10,11,13,14,15,16。エチジウムと2-ヒドロキシエチジウムの蛍光スペクトルはわずかに異なるだけであるため、スーパーオキシド産生に続発する細胞に見られるROSレベルの大部分は、DHE蛍光製品を使用して検出および測定できます。これらのROS種は、480 nmの波長励起と610 nmの波長発光を用いて同定される15,16,17。
特定の蛍光ROS検出プローブを選択することに加えて、細胞内ROSを測定するための高感度検出方法を選択することが重要です。したがって、細胞内ROSレベルの正確な評価は、罹患細胞または放射線、毒性化合物、遺伝毒性物質などのさまざまな環境ストレス要因にさらされた細胞で発生する酸化還元平衡の乱れ状態を特定するための鍵となります18。ROSは細胞内でよく発生する現象であり、さまざまな細胞シグナル伝達活性の調節に関与するため、ROSの堅牢な検出法が不可欠です。細胞内のROS産生のこのようなハイスループット評価を可能にするために、このプロトコルではハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを使用してROS種を測定します。現在のプロトコルは、多くの毒物学研究において決定的に重要な細胞内ROS産生のハイスループット分析を可能にします19。このプロトコルは付着したhepatocellular癌腫のセルの細胞内ROSを検出し、測定するために容易で、多目的な解決を提供することを向ける。H2O2 およびメナジオンの化学試薬は、制御された高スループット設定におけるROS産生の相対レベルを測定するための強力なROS刺激剤として使用される。このプロトコルは、必要に応じて、適切な条件下で接着細胞および非接着細胞のROS産生を測定するように微調整できます。
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Protocol
1. 細胞培養
- 試験細胞(HepG2、HUH7、およびJHH4肝細胞癌細胞)を96ウェルプレートに播種し、10,000細胞/ウェルの播種密度で、ウェルあたり200 μLの最終播種量で播種します。
- HepG2細胞を培養する前に、96個のプレートウェルをIV型コラーゲン(50 μg/mL)で室温(RT)で2時間コーティングします。ストックコラーゲンの固化を防ぐには、ストック溶液を氷に入れ、続いて目的の濃度に希釈プロセスを開始します。
- 2時間のインキュベーション期間後、余分なコラーゲンを吸引し、1x PBSでウェルを3回洗浄します。
- 加湿インキュベーター内で、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で37°C、5%CO2 濃度で一晩細胞を培養します。
- 翌日、または80%〜90%のコンフルエントに達したら、いずれか早い方で、細胞をH2O2(未処理、250μM、500μM、750μM、および1000μM)およびメナジオン(未処理、25μM、50μM、75μM、100μM)でそれぞれ30分間処理して、代表的な酸化ストレスを誘導する。
- あるいは、細胞内に酸化ストレスを誘発することができる目的の試験物質で細胞を試験することを選択します。
2. 細胞のDHE染色のためのストックおよび希釈溶液調製
- 5 mg の DHE を 1 mL の DMSO に溶解して、DHE 原液 (5 mg/mL または 15.9 mM) を調製します。
- DHEストック溶液を二重蒸留オートクレーブ水で最終濃度100 μMに希釈します。
- 色素の凍結融解プロセス(時間の経過とともに蛍光特性を損なう可能性があります)を避けるために、濃度100 μMの1.5 mL遠心分離チューブにアリコートを数本調製し、-20°Cで保存します。
- 最終使用濃度を 10 μM にするには、100 μM DHE 濃度のアリコートを使用し、予め温めた DMEM 培地で希釈します。
注:作業溶液は、実験当日に新鮮に調製する必要があります。 - 作業用蛍光染料溶液を5〜10秒間ボルテックスして、染料が適切に混合されるようにします。
3. DHE染色プロセス
- 各ウェルから薬物または被験物質を含む培地を取り出し、1x PBSまたはDMEMで1回穏やかに洗浄します。
注:実験で添加または洗浄のステップを実行するときは、細胞とピペッターが直接接触しないようにすることが重要です。これは、ウェルの側面に沿ってPBSを静かにピペッティングすることで実現でき、細胞への潜在的な機械的損傷を最小限に抑えることができます。ピペッターが細胞に直接触れないようにすることで、実験期間中、細胞の完全性と生存率を維持することができます。 - 10 μM DHE(ワーキング溶液)を含むDMEM培地100 μLを各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 30分間のインキュベーション期間後、DHE含有培地を取り除き、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で各ウェルを3回穏やかに洗浄します。これは、迅速なターンアラウンドを保証するために、マルチチャンネルピペッターで行うことができます。
- 200 μL の 1x PBS を Hoechst 33342 核染色色素とともに各ウェルに室温で 10 分間添加します。
- Hoechst 33342核染色溶液をウェルから取り出し、各ウェルに200 μLの1x PBSを加えます。
注:固定細胞を得るには、生細胞と同じプロトコルに従い、処理後に 4% PFA を 5 分間添加し、DHE 染色を行うという 1 つの追加ステップに従います。PFA溶液を除去し、1x PBSで細胞を洗浄します。次に、細胞を核染色色素と10分間インキュベートします。 - プレートをハイコンテントスクリーニングプラットフォーム、蛍光顕微鏡、またはプレートリーダーに移し、できるだけ早く画像を取得してください。
4.画像取得と強度測定
- プレートローディング
- データ取得用のCellomics CX7ハイコンテントスクリーニング(HCS)ソフトウェアを開きます。
- データ内の画像がぼやけたりぼやけたりしないように、使用する特定の96ウェルプレートを使用して、メーカーの仕様に従ってイメージングプラットフォームを事前に慎重に校正します。
注:さまざまなベンダーのマルチウェルプレートは、材料特性が異なる場合があり、得られる最終画像の品質に影響を与える可能性があります。 - 校正が完了したら、プレートのブランドに固有のシステムパラメータを機器データベースに保存し、将来のデータ取得に再利用します。
- 調製したサンプルの入ったプレートを、HCSイメージングシステムの加熱ステージに慎重に置きます。プレートがマイクロプレートホルダー上でイメージングのためにしっかりと配置され、正しい向きになっていることを確認してください(つまり、リーダーステージでA1とマークされたラベルを見つけてから、マイクロプレートを回転させて、ウェルA1の位置がステッカーの角と一致するようにします)。
- マイクロプレートをそっと押し下げて、ステージに対して平らに固定されるようにします。HCSシステムでのプレートのレベリングが不均一であると、画像取得のエラーにつながる可能性があります。
- プレートを配置したら、 Ctrl キーを押したまま、ソフトウェアの[プレートのロード/アンロード]ダイアログで [Ctrl]-[OK ]をクリックします。
- イメージングパラメータの選択
- HCSイメージングシステムでは、Cellomicsバイオアプリケーションインターフェースで ターゲット活性化 モードを開き、(a)核染色および(b)DHE蛍光プローブデータ取得と互換性のある2チャンネルセットアッププロトコルを使用して新しいプロトコルを作成します。現在のプロトコルでは、フィルター 386_BGSRS_BGSRS、480_BGS_RS、および386_BGS_RSは、それぞれ(a)Hoechst 33342核染色、(b)全ROS生成、および(c)スーパーオキシドラジカル検出に使用されました。これらのフィルターの選択は、このプロトコルの一部として使用される各色素(DAPIおよびDHE)の発光特性の特定の重複によって決定されました。
注:フィルターの命名規則(例:386-23_BGRFRN_BGRFRN)は、23nmの帯域幅を持つ386 nmの光でサンプルを励起し、その後に特定の波長範囲で青色(B)、緑色(G)、赤色(R)、遠赤外(FR)、および近赤外(N)光を通過させるダイクロイックフィルターを指し、386_BGS_RSはダイクロイックの後にBGSおよびRS発光波長光を通過させる発光フィルターを指します。 - 必要に応じて、ソフトウェアプロトコルインターフェース内で画像取得プロセスの目的(10倍または20倍の倍率など)を指定します。
- 実験に必要なイメージングの詳細と解像度の望ましいレベルに応じて、適切な対物レンズ倍率を選択してください。ただし、各目標の解像度は固定されています。解像度を高くすると、プラットフォーム上の対物レンズを変更する必要があります。現在のプロトコルでは、20倍、0.45 NAの対物レンズが使用されていますが、これはこのプロトコルで使用されているハイコンテントスクリーニングプラットフォームの一部です。
注:20倍の対物レンズは、イメージング解像度の詳細と、経時的なROSの変化を捉えるために必要な取得速度との間の適切なトレードオフを表しています。より高い倍率の対物レンズ(例:40倍)を選択できますが、これは取得時間が長くなります。 - プロトコルの特定の要件に従って、露光時間、カメラのビニング、Zスタック間隔など、画像取得カメラの露出設定を指定します。
注:露光時間(多くの場合、ミリ秒単位)は、使用する特定の蛍光色素のシグナル強度と感度によって異なります。これは、色素の濃度と染色品質に基づいて、実験ごとに若干異なる場合があります。現在のプロトコルでは、取得のパラメータは次のように固定されています - ターゲット%-35%、画像取得モード-1104 x 1104(2x2ビニング付き)、および対物レンズ20x、0.45 NA。これらのパラメータは、特定の実験条件に従って設定することができます。
- HCSイメージングシステムでは、Cellomicsバイオアプリケーションインターフェースで ターゲット活性化 モードを開き、(a)核染色および(b)DHE蛍光プローブデータ取得と互換性のある2チャンネルセットアッププロトコルを使用して新しいプロトコルを作成します。現在のプロトコルでは、フィルター 386_BGSRS_BGSRS、480_BGS_RS、および386_BGS_RSは、それぞれ(a)Hoechst 33342核染色、(b)全ROS生成、および(c)スーパーオキシドラジカル検出に使用されました。これらのフィルターの選択は、このプロトコルの一部として使用される各色素(DAPIおよびDHE)の発光特性の特定の重複によって決定されました。
- イメージング構成パラメーター
注意: イメージングパラメータを設定したら、ソフトウェアインターフェイスを使用して画像収集プロセスを開始できます。- 画像収集パラメーター
- 装置で利用可能なさまざまなアルゴリズム(光学系-アイソデータ、固定、および三角形)を使用して、関心のある主要な追跡オブジェクト(細胞の核)を特定します。
注:このプロトコルでは、プライマリオブジェクトの識別とマーキングにisodataメソッドが使用されます。 - オブジェクト(存在する場合)を形状または強度パラメータでセグメント化します。
- 各細胞タイプに固有の目的のサイズ、形状、および強度パラメータに基づいて、主要なオブジェクトを検証します。
- 次に、この主要オブジェクトの周囲に「関心領域」(ROI)を定義します。
注:ROIは、蛍光色素の強度が細胞タイプ間で一貫して再現可能であることが特定される場所を定義する、データ取得の重要なパラメータです。ROIは、機器の異なるチャンネルで各一次追跡オブジェクト(細胞)について測定される主要なパラメータ(色素の強度など)を定義します。ROIは、各細胞の核の周りの円またはリングの形態で定義され得る。HCSソフトウェアは、自動化された方法でセグメント化および分析された各細胞のROIの制限内で、チャネル2のDHE蛍光色素マーカーの強度を自動的に取得します。 - 主物体(核)の周囲に20μmの円を設定します。この研究では、このプロトコルで使用したさまざまな細胞株(HepG2、JHH-4、およびHUH-7)のおおよそのサイズに基づいて、20 μmの距離を選択しました。細胞の周りの20 μmのリングROIは、一貫した再現性のある方法で蛍光強度を得ました。
注:ROIを選択する際の重要なパラメータは、セル領域を適切にカバーする能力です。円形 ROI のサイズは、セル サイズによって異なります。セルが大きいほどROIが大きくなり、ROIが小さくなるとROIも大きくなります。これらのパラメータは、各細胞タイプおよび目的の蛍光色素について事前に決定する必要があります。
- 装置で利用可能なさまざまなアルゴリズム(光学系-アイソデータ、固定、および三角形)を使用して、関心のある主要な追跡オブジェクト(細胞の核)を特定します。
- 画像収集パラメーター
- 母集団の特性評価と保存する特徴量の選択
- HCSイメージングプロトコルでさまざまな取得パラメータを定義したら、HCSシステムをデータ取得モードに設定します。
- このプロトコルの画像取得パラメータは、スキャン限界を1000セル/ウェルとし、フィールドあたり最小要件を10オブジェクト(セル)に設定しました。
注:各ウェルについて評価されたフィールド数は、最終的に1000に達したセル数に基づいて決定されました。HCSシステムは、1000細胞/ウェルの目標集団が得られるまで、ウェル内のさまざまな場所の検索を続けます。したがって、取り込み速度は、96ウェルプレートの各ウェルに存在するコンフルエントと総細胞数に依存します。現在のプロトコルでは、チャネル 2 の総強度と平均強度(スーパーオキシドラジカルと総 ROS 生成量を表す)を各ウェルから収集し、さらに下流の分析を行いました。
- データと統計分析
- チャネル 2 の平均平均強度を計算します (ROS 値とスーパーオキシド ラジカルの合計を表します)。
注:強度値を計算するためのすべての実験は、各投与レベルで条件ごとに6回の繰り返しで3回繰り返されました。 - 一元配置分散分析またはt検定を実行して、さまざまな検定条件間の強度値の差を測定します。
- チャネル 2 の平均平均強度を計算します (ROS 値とスーパーオキシド ラジカルの合計を表します)。
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Representative Results
ジヒドロエチジウム(DHE)は、細胞内のROS状態に関する特異的な情報を提供するスーパーオキシド応答性蛍光色素です。DHE色素は、細胞質内で本質的に青色蛍光を発します。しかし、スーパーオキシドラジカルと相互作用すると、2-ヒドロキシエジウムに変換され、赤色の波長(>550 nm)の蛍光を発します(図1)。DHE色素は、細胞や核に容易に輸送されます。放出された蛍光は、多くのラボで一般的に利用可能な蛍光顕微鏡装置で視覚化できます。現在の研究では、複数の肝細胞癌細胞株(HUH7、JHH4、およびHepG2細胞)に対するDHE色素の有用性を、ROS種生成のプローブとして、ハイコンテントスクリーニングプラットフォームでテストしました。細胞を2つのROS生成剤((a)過酸化水素および(b)メナジオンで用量依存的に30分間処理し(投与の詳細については図2および図3を参照)、細胞に酸化ストレスを誘導し、続いて96ウェルプレートでDHE色素標識を行いました。H2O2およびメナジオンの両方が、用量依存的に3つの細胞株すべてにおいて蛍光強度を劇的に増加させた。ハイスループットスクリーニングプラットホーム内の画像セグメンテーションおよび定量アルゴリズムを使用して、ROS 誘起 DHE 蛍光の強度を 6 回の繰り返しにわたってウェルあたり 1,000 個の細胞で定量しました。3 つの独立した反復を測定し、結果を集計して分析しました。Hoechst 33342核染色は、接着細胞が各ウェルに存在する平面を特定する上で重要な役割を果たします。さらに、2-OH-E+およびE+蛍光は、ハイスループットスクリーニングプラットフォーム上で、試験細胞の核と細胞質の両方でそれぞれ検出できます(図4を参照)。
H2O2への曝露は、用量依存的に分析されたすべての細胞株にわたってROS誘導性蛍光の統計的に有意な増加をもたらした(図2;下パネルを参照のこと)。しかし、そのような用量依存的な反応は、メナジオン曝露の場合には見られませんでした。.メナジオンでは、JHH4細胞株は用量依存的に蛍光強度の増加を示しましたが、HepG2およびHUH7細胞株では、メナジオン濃度が高い場合にのみ蛍光強度の有意差が観察されました(図3、下パネルを参照)。ROS生成応答におけるこれらの違いは、H2O2およびメナジオンのROS産生の異なるメカニズムによるものである可能性がある。H2O2は、より直接的な方法で(例えば、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼなどの抗酸化酵素の作用を通じて)細胞内でROS形成を誘発するが、メナジオンは、誘導されたミトコンドリア機能障害を介して間接的にROS種を生成すると仮定されている。ROS産生の間接的なメカニズムにより、DHE蛍光はメナジオンで発現するまでにより多くの時間を必要とする場合があります。これらの知見は、ROS依存性DHE蛍光が酸化ストレス曝露の持続時間、濃度、および細胞型に敏感であることを示しています。したがって、固有の細胞タイプごとに実験プロトコルを最適化することは必須です。さらに重要なことに、このプロトコルは、毒物学、がん生物学、薬物スクリーニングなどの分野で使用される、ハイスループット方式でのROS検出剤としてのDHE色素の使用の実現可能性を実証しています。
図1:DHE蛍光分子がそれぞれ2-ヒドロキシエチジウム(2-OH-E+)およびエチジウム(E+)に酸化変換される経路を示す模式図。 2-OH-E+ とE+ の蛍光発光スペクトルは、480 nmの励起で重なり合っています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:過酸化水素処理は、用量依存的に細胞内のROSレベルを上昇させます。 肝細胞癌細胞−(A)HUH7、(B)JHH4、および(C)HepG2を、250μM、500μM、750μM、および1000μMの用量でH2O2で30分間処理した。細胞を培養培地中でDHE(10 μM)色素でさらに30分間染色し、続いてHoechst 33342核染色を行いました。各ウェルで合計1000個の細胞をカウントした。DHE蛍光の線量依存的な増加は、3つの細胞株すべてで観察されます(上パネル)。500 μM以上を投与したすべての細胞株で、蛍光の統計的に有意な増加が見られます(下パネル)。各データセットは、3 つの独立した実験から得られた 96 ウェルプレートでの平均 6 回の反復です(n = 3)。一元配置分散分析検定(**** - p < 0.0001、*** - p < 0.001、画像スケールバー - 50 μm)を用いて、処理条件を未処理のサンプルと比較しました。
図3:メナジオン処理は、用量依存的に細胞内ROSレベルを増加させます。 肝細胞癌細胞 - (A) HUH7、(B) JHH4、および (C) HepG2 を、25 μM、50 μM、75 μM、および 100 μM の用量で 30 分間メナジオンで処理しました。細胞を培養培地中でDHE(10 μM)色素でさらに30分間染色し、続いてHoechst 33342核染色を行いました。各ウェルで合計1000個の細胞をカウントした。DHE蛍光の線量依存的な増加は、3つの細胞株すべてで観察されます(上パネル)。統計的に有意な蛍光の増加は、最大線量(100 μM、下パネル)で一貫して見られます。異なる細胞株(JHH4 > HUH7 > HepG2)にわたるメナジオンの残りの用量にばらつきが観察されます。.各データセットは、3 つの独立した実験から得られた 96 ウェルプレートでの平均 6 回の反復です(n = 3)。一元配置分散分析検定(**** - p < 0.0001、*** - p < 0.001、画像スケールバー - 50 μm)を用いて、処理条件を未処理のサンプルと比較し ました。
図4:シングルセルDHE蛍光 - (A)過酸化水素と(B)メナジオンで30分間処理した後に観察されたDHE蛍光の変化の拡大図。DHE蛍光の細胞質および核の変化は、異なる細胞で観察されます。ハイコンテントスクリーニングプラットフォームによって生成された自動セグメンテーションマスクも見られます。画像スケールバー - 10 μm。 倍率-20倍。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:過酸化水素に応答したスーパーオキシド駆動DHE蛍光のイメージング。 肝細胞癌細胞−(A)HUH7、(B)JHH4、および(C)HepG2を、250μM、500μM、750μM、および1000μMの用量でH2O2で30分間処理した。その後、細胞を培養培地中でDHE(10 μM)色素でさらに30分間染色しました。続いて、細胞を386nmのLEDで照らし、>560nmの蛍光イメージングを採取した。スペクトルのクロストークを避けるため、核対比染色は行わなかった。500μM>用量では、DHE蛍光の用量依存的な増加が観察されます。 UV照射DHE蛍光は、スーパーオキシドラジカル生成の大部分が原因であると予想されます。各データセットは、2 つの独立した実験から得られた 96 ウェルプレートでの平均 6 回の反復です(n = 2)。処理条件は、一元配置分散分析(**** - p < 0.0001、*** - p < 0.001、画像スケールバー - 50 μm)を使用して未処理のサンプルと比較しました。
補足図2:メナジオンに応答したスーパーオキシド駆動DHE蛍光のイメージング - 肝細胞癌細胞 - (A) HUH7、(B) JHH4、および (C) HepG2 を、25 μM、50 μM、75 μM、および 100 μM の用量で 30 分間メナジオンで処理しました。その後、細胞を培養培地中でDHE(10 μM)色素でさらに30分間染色しました。過酸化水素と同様に、DHE蛍光の用量依存的な増加が観察されました。.各データセットは、2 つの独立した実験から得られた 96 ウェルプレートでの平均 6 回の反復です(n = 2)。処理条件は、一元配置分散分析(**** - p < 0.0001、*** - p < 0.001、画像スケールバー - 50 μm)を使用して未処理のサンプルと比較しました 。
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Discussion
本研究では、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いたスーパーオキシド駆動の細胞内活性酸素種(ROS)産生を評価するプロトコルをハイコンテントスクリーニングシステム上に確立しました。文献で入手可能な現在のプロトコルの大部分は、ROS種を定量するための蛍光イメージングプローブとしてDCFH-DAを使用しています。しかし、複数の研究により、DCFH-DAは細胞内ROSの測定に理想的なプローブではないことが示されています。プローブとしてのDCFH−DAの不適性について仮定された種々の理由は、−(i)DCFH−DAはH2O2と直接反応を示さないため、細胞内のH2O2レベルを評価するための不適切な色素となる−(i)DCFH−DAはH2O2と直接反応を示さないため、細胞内のH2O2レベルを評価するための不適切な色素となる。(ii)OH.、NO2.、ONOO-などのいくつかの1電子酸化種は、DCFHをDCFに酸化する。 (iii)遷移金属、シトクロムc、およびヘムペルオキシダーゼは、酸素およびH2O2の存在下でDCFH酸化を促進することができる。(iv)最も重要なことは、DCFH−DAは、酸素の存在下で、追加のスーパーオキシドの生成を誘導する中間生成物DCFH.-/DCFを生成することである。O2.−による変異は、追加のH2O2を生成し、これは、蛍光強度の人工的な増加およびROSレベルを誤って上昇させる可能性がある。複数の著者は、細胞内H2O2および他のROS種8,9,10,11,12,13,14を検出するための信頼性の低い蛍光プローブとしてのDCFH−DAの使用を検討している。
DCH-DAとは対照的に、DHEはスーパーオキシドラジカルと特異的に反応し、蛍光生成物である2-ヒドロキシエチジウム(2-OH E+)を生成します。非スーパーオキシドROS種は、DHEと反応して、第2の蛍光生成物であるエチジウム(E+)を生成することもできます。2-OH-E+とE+の蛍光スペクトルは比較的類似していますが、これら2つの分子は細胞内ROS種とDHEの間の特異的な相互作用の最終生成物を表しており、酸化ストレスによって細胞内で観察される総蛍光強度の原因となります。いくつかの研究では、より短いUV範囲波長(<400 nm)での選択的励起は、(E+とは対照的に)2-OHエチジウム励起に特異的であり、したがってスーパーオキシドラジカル生成に特異的である可能性があることが示されています7,12,14。これは、386 nmのLED光のみでセルを励起することによって評価されました。波長480 nmの励起に対して、波長560 nmでは発光強度の低下が観察されました(補足図1および補足図2を参照)。しかし、これが2-OHエチジウム蛍光のみによるものであるとは断言できず、現在のアプローチの潜在的な欠点を表しています。他の研究では、UV励起(例:386 nm)も、2-OHエチジウム7,15と比較して低いレベルですが、同時にエチジウム蛍光発光を引き起こす可能性があることが示されています。いずれにせよ、私たちのプロトコルは、ハイコンテントイメージングおよびスクリーニングシステムを使用して、細胞内ROS産生の大部分の定量的差を測定するためのより優れた色素の代替品としてDHEを確立します。
(DCFH-DAで見られるような)ROS生成の中間ドライバーの欠如は、細胞内ROS産生を評価するためにDHEを使用する上で大きな利点であると仮定されています。しかし、このDHE蛍光のメカニズムはまだしっかりと確立されていません。ROSレベルの正確な定量化が必要な場合は、HPLCや液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)法などの追加の直交定量的検証方法を使用して、細胞内の2-OH-E+レベルを正確に推定することをお勧めします8,9,13.ただし、HPLCおよびLC-MS法では、評価のために細胞の凝集と可溶化が必然的に伴うことに注意する必要があります。したがって、現在のプロトコルのように蛍光ベースのイメージング法でコード化された時空間情報は、HPLCおよびLC-MSでは失われ、イメージングベースのROS評価法の主な利点を表しています。DHEの赤方偏移蛍光のさらなる利点は、赤色光によって運ばれるエネルギーが低いため、より長い波長の光(赤色)が細胞に対して毒性が低いことです。
相対的な細胞内ROS変化を測定するためのDHE蛍光の用量依存性は、酸化ストレス誘導剤としてメナジオンおよび過酸化水素を使用してテストされました。メナジオンと過酸化水素は、ROSと酸化ストレス生成のメカニズムが異なるため、試験物質として選択されました20,21。メナジオン曝露によるROS産生は間接的であるが(ミトコンドリア機能障害を介して)、H2O2はより直接的な方法で酸化ストレスを生じる。メナジオンの濃度が上昇すると、直鎖状、再現性、用量依存的な方法でDHE蛍光産生が増強されました。メナジオンと同様に、H2O2は、フェントン化学を介して直接的な方法でヒドロキシルラジカル(OH)を生成することができるROSのよく知られた誘導剤である22。線形および用量依存的な応答は、H2O2曝露によるDHE蛍光において同様に観察された。特にスーパーオキシドラジカルに対するDHEの選択性のために、それはH2O 2と直接反応しない。 その代わりに、生成された細胞内スーパーオキシドラジカルは、最初にH2O2と反応して、ハーバーワイス反応およびフェントン反応を介してヒドロキシラジカルなどの二次ROS種を形成し、次いでDHE蛍光23によって検出される。細胞内ROS産生の大部分を測定することにより、2つの異なる酸化性物質に応答するDHEの蛍光発光スペクトルは、現在のプロトコルで確立されています8,13。これらの結果は、ハイスループットスクリーニングアプローチを用いた細胞内ROSレベルの検出および定量のためのより良い代替手段としての蛍光DHE色素の有用性を確立しています。
DHEの優れた選択性、感度、および光学特性により、現在のプロトコルで確立されているように、ROS産生と酸化損傷をハイスループットで調査するための貴重な代替手段となります。私たちの研究室での今後の研究では、ハイスループット設定のさまざまな生理学的および病理学的条件下でのROSと細胞シグナル伝達メカニズムの間の交差反応性におけるROSマーカーとしてのDHEの役割を探ります。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
RKとRRGは、NIH NIGMS助成金P20 GM130422を通じて、UNM Center for Metals in Biology and Medicine(CMBM)からの助成金の支援を受けました。RRGは、NM-INSPIRES P30助成金1P30ES032755からのパイロット賞の支援を受けました。CX7 Cellomics装置のイメージング・コア・サポートは、NIHの助成金P20GM121176から資金提供を受けたAIMセンター・コアを通じて提供されました。シャリーナ・デサイ博士とリー・チェン博士には、CX7 Celomicsイメージング・プラットフォームの使用に関する技術的な問題について貴重なご支援をいただき、感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
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