Summary
В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2'-7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака - HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках 1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАДФН-оксидазы в клетках. Метаболизм молекул пищи (например, глюкозы) происходит через путь окислительного фосфорилирования в митохондриальном матриксе. Исходный уровень продукции АФК необходим для регуляции нормальных физиологических сигнальных процессов клеток. Известно, что многие ключевые белковые молекулы, которые являются частью метаболических сигнальных путей глюкозы (например, Akt и PTEN), реагируют на внутриклеточные уровни АФК. Кроме того, АФК продуцируются различными внутриклеточными ферментами, такими как ксантиноксидаза, синтаза оксида азота и пероксисомальные компоненты, как часть клеточных ферментативных путей 1,2. В отличие от естественных источников АФК, некоторые факторы окружающей среды, такие как ксенобиотики, инфекционные агенты, ультрафиолетовое излучение, загрязнение, курение сигарет и радиация, также приводят к чрезмерной выработке АФК, которые являются ключевым фактором внутриклеточного окислительного стресса 1,3. Повышенный клеточный окислительный стресс может привести к повреждению нативных биомолекул внутри клетки, таких как липиды, белки и ДНК, вызывая различные заболевания, такие как рак, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, хроническое воспаление и нейродегенеративные расстройства 1,3,4. Таким образом, точные измерения АФК необходимы для понимания клеточных механизмов, участвующих в патофизиологии заболеваний, вызванных окислительным стрессом.
Из-за коротких временных рамок производства и элиминации АФК внутри клеток количественные измерения различных радикалов АФК остаются сложной задачей. Такие методы, как электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)5, жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и визуализация на основе флуоресцентного зонда, используются для измерения различных клеточных АФК6. В то время как такие методы, как ЭПР и ВЭЖХ, дают количественно точные оценки, эти методы включают в себя разрушение пространственной морфологии клеток и обычно проводятся в форме глобальных и массовых измерений образца. В отличие от этого, методы, основанные на визуализации, такие как методы на основе флуоресцентных зондов, сохраняют клеточную морфологию и пространственный контекст генерации АФК. Однако специфичность различных флуоресцентных зондов для различных типов радикалов АФК не была хорошо установлена 7,8. Несколько флуоресцентных зондов, таких как дигидроэтидий (ДГЭ), дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA), дигидрородамин (DHR), диметилантрацен (DMA), 2,7-дихлордигидрофлуресцеин (DCFH), 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) и MitoSox, доступны для коммерческого обнаружения АФК. В последние десятилетия DHE, MitoSox и DCFH-DA являются широко используемыми флуоресцентными красителями для измерения АФК в клетках и тканях 8,9. DCFH-DA является широко используемым красителем для обнаружения внутриклеточногоH2O2и окислительного стресса. Несмотря на популярность DCFH-DA, многочисленные предыдущие исследования показали, что он не может быть надежно использован для измерения внутриклеточного уровняH2O2и других уровней АФК 8,9,10,11,12,13,14.
Напротив, флуоресцентный зонд дигидроэтидий (ДГЭ) проявляет специфическую реакцию на внутриклеточный супероксидный радикал (O2-). В то время как супероксидный радикал является одним из многих видов АФК, наблюдаемых в клетках, он является важным радикалом, участвующим в восстановлении переходных металлов, превращении в пероксинитрат и образовании гидропероксидов, а также в других внутриклеточных эффектах. ДГЭ быстро поглощается клетками и имеет флуоресцентное излучение в красном диапазоне длин волн15. При реакции с супероксидным радикалом ДГЭ образует красный флуоресцентный продукт, 2-гидроксиэтидий (2-OH-E+). Таким образом, ДГЭ можно рассматривать как специфический зонд для детектирования супероксида. Однако ДГЭ также может подвергаться неспецифическому окислению ONOO- или OH, H2O2и цитохромом C с образованием второго продукта флуоресценции, этидия E+, который может влиять на измеренные уровни 2-OH-E+. Тем не менее, эти продукты 2-OH E+ и E+ в сочетании представляют собой основную часть общего количества клеточных видов АФК, наблюдаемых внутри клетки при окрашивании ДГЭ. E+ интеркалируется в ДНК, значительно усиливая ее флуоресценцию 8,9,10,11,13,14,15,16. Поскольку спектры флуоресценции этидия и 2-гидроксиэтидия различаются лишь незначительно, большинство уровней АФК, наблюдаемых в клетке, вторичной по отношению к производству супероксида, могут быть обнаружены и измерены с помощью продуктов флуоресценции ДГЭ. Эти виды АФК идентифицированы с помощью возбуждения с длиной волны 480 нм и излучения с длиной волны 610 нм 15,16,17.
В дополнение к выбору конкретного флуоресцентного датчика для обнаружения АФК, важно выбрать чувствительный метод обнаружения для измерения внутриклеточных АФК. Таким образом, точная оценка внутриклеточных уровней АФК является ключом к выявлению нарушений окислительно-восстановительного баланса, возникающих в больных клетках или клетках, подвергшихся воздействию различных стрессоров окружающей среды, таких как радиация, токсикологические соединения и генотоксическиеагенты. Поскольку АФК является часто встречающимся явлением в клетках, которое отвечает за регуляцию различных сигнальных активностей клеток, надежные методы обнаружения АФК имеют важное значение. Чтобы обеспечить такую высокопроизводительную оценку продукции АФК в клетках, этот протокол использует платформу скрининга с высоким содержанием (HCS) для измерения видов АФК. Существующий протокол позволяет проводить высокопроизводительный анализ внутриклеточной продукции АФК, что имеет решающее значение во многих токсикологических исследованиях19. Этот протокол направлен на предоставление простого и универсального решения для обнаружения и измерения внутриклеточных АФК в адгезивных клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Химические реагенты H2O2 и менадион используются в качестве мощных стимуляторов АФК для измерения относительных уровней продукции АФК в контролируемых и высокопроизводительных условиях. Этот протокол может быть точно настроен для измерения продукции АФК в адгезивных и неадгезивных клетках при соответствующих условиях, если это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура
- Засейте исследуемые клетки (клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, HUH7 и JHH4) в 96-луночную пластину с плотностью засева 10 000 клеток/лунку при конечном объеме посева 200 мкл на лунку.
- Перед культивированием клеток HepG2 покройте 96 лунок для планшетов коллагеном IV типа (50 мкг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре (RT). Чтобы избежать затвердевания исходного коллагена, поместите исходный раствор в лед и впоследствии начните процесс разбавления до желаемой концентрации.
- После 2-часового инкубационного периода отсасывайте излишки коллагена и трижды промойте лунки с помощью 1x PBS.
- Культивируйте клетки в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco в течение ночи при температуре 37 °C и концентрацииCO2 5% во влажном инкубаторе.
- На следующий день или по достижении 80%-90% слияния, в зависимости от того, что наступит раньше, обработайте клеткиH2O2 (необработанные, 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1000 мкМ) и Menadione (необработанные, 25 мкМ, 50 мкМ, 75 мкМ, 100 мкМ) соответственно в течение 30 мин, чтобы вызвать репрезентативный окислительный стресс.
- В качестве альтернативы можно протестировать клетки с помощью желаемого тестового вещества, способного индуцировать окислительный стресс в клетках.
2. Приготовление сырья и разбавленного раствора для окрашивания клеток ДГЭ
- Приготовьте исходный раствор ДГЭ (5 мг/мл или 15,9 мМ), растворив 5 мг ДГЭ в 1 мл ДМСО.
- Разбавьте исходный раствор DHE двойной дистиллированной автоклавной водой до конечной концентрации 100 мкМ.
- Чтобы избежать процесса замораживания и оттаивания красителя (который со временем может повредить флуоресцентные свойства), приготовьте несколько аликвот в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл с концентрацией 100 мкМ и храните их при -20 °C.
- Для достижения конечной рабочей концентрации 10 мкМ используйте аликвоту концентрации ДГЭ 100 мкМ и разбавляйте ее предварительно нагретой средой DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор должен быть приготовлен свежим в день эксперимента. - Встряхните рабочий раствор флуоресцентного красителя в течение 5-10 с, чтобы обеспечить правильное перемешивание красителя.
3. Процесс окрашивания DHE
- Извлеките среду, содержащую лекарственное средство или тестовое вещество, из каждой лунки и осторожно промойте ее один раз с помощью 1x PBS или DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этапов добавления или промывки в эксперименте крайне важно избегать прямого контакта между клетками и пипеттором. Этого можно достичь, аккуратно пипетируя PBS вдоль стенок лунок, чтобы свести к минимуму любое потенциальное механическое повреждение клеток. Обеспечение того, чтобы пипеттор не касался клеток напрямую, поможет сохранить целостность и жизнеспособность клеток на протяжении всего эксперимента. - Добавьте в каждую лунку 100 мкл ДМЭМ-среды, содержащей 10 мкМ ДГЭ (рабочего раствора), и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
- После 30-минутного инкубационного периода удалите среду, содержащую ДГЭ, и осторожно промойте каждую лунку три раза 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Это может быть выполнено с помощью многоканального пипетки, чтобы обеспечить быстрое выполнение.
- Добавьте 200 мкл 1x PBS в каждую лунку с ядерным красителем Hoechst 33342 в течение 10 мин при RT.
- Извлеките раствор для окрашивания ядер Hoechst 33342 из лунки и добавьте 200 мкл 1x PBS в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения фиксированных клеток следуйте тому же протоколу, что и для живых клеток, с одним дополнительным этапом добавления 4% PFA в течение 5 минут после обработки и окрашивания DHE. Удалите раствор PFA и промойте ячейки с помощью 1x PBS. Затем инкубируют клетки с ядерным красителем в течение 10 минут. - Переместите планшет на платформу для скрининга с высоким содержанием, флуоресцентную микроскопию или планшет для считывания пластин для получения изображения как можно быстрее.
4. Получение изображений и измерение интенсивности
- Загрузка пластин
- Откройте программное обеспечение Cellomics CX7 для скрининга с высоким содержанием (HCS) для сбора данных.
- Тщательно откалибруйте платформу визуализации в соответствии со спецификациями производителя заранее с помощью специальной 96-луночной пластины для использования, чтобы избежать нечетких или размытых изображений в данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многолуночные планшеты различных производителей могут иметь различные свойства материала и могут влиять на качество получаемых окончательных изображений. - После калибровки сохраните системные параметры, специфичные для марки пластины, в базе данных прибора и повторно используйте их для сбора данных в будущем.
- Осторожно поместите планшет с подготовленными образцами на нагретый столик системы визуализации HCS. Убедитесь, что пластина надежно расположена и находится в правильной ориентации для визуализации на держателе микропланшета (т. е. найдите этикетку с маркировкой A1 на столе считывателя, затем поверните микропланшет так, чтобы расположение лунки A1 совпадало с углом наклейки).
- Осторожно надавите на микропластину, чтобы она плотно прилегала к сцене. Неравномерное выравнивание пластины в системе HCS может привести к ошибкам при получении изображения.
- После того, как пластина будет установлена на место, нажмите и удерживайте клавишу Ctrl , затем нажмите Ctrl-OK в диалоговом окне Загрузка/Выгрузка пластины в программном обеспечении.
- Выбор параметров визуализации
- В системе визуализации HCS откройте режим Target Activation (Активация мишени) в интерфейсе Cellomics bio-applications (Биоприложения Cellomics) и создайте новый протокол с использованием двухканального протокола настройки, совместимого с (а) ядерным окрашиванием и (б) сбором данных флуоресцентного зонда DHE. В действующем протоколе фильтры 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS и 386_BGS_RS использовались для (а) ядерного окрашивания Hoechst 33342, (б) общего производства АФК и (в) обнаружения супероксидных радикалов, соответственно. Выбор этих фильтров был обусловлен специфическим перекрытием эмиссионных свойств каждого красителя (DAPI и DHE), используемых в рамках этого протокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соглашение об именовании фильтров, например, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, относится к возбуждению образца светом с длиной волны 386 нм и шириной волны 23 нм, за которым следует дихроичный фильтр, пропускающий синий (B), зеленый (G), красный (R), дальний красный (FR) и ближний инфракрасный (N) свет в определенных диапазонах длин волн, а 386_BGS_RS относится к эмиссионному фильтру, который пропускает свет с длиной волны излучения BGS и RS после дихроичного. - При необходимости укажите цели процесса получения изображения в интерфейсе программного протокола, такие как 10-кратное или 20-кратное увеличение.
- Выберите подходящее увеличение объектива в зависимости от желаемого уровня детализации изображения и разрешения, необходимого для эксперимента. Тем не менее, решение каждой задачи фиксировано. Более высокая детализация разрешения потребует изменения цели на платформе. В текущем протоколе используется объектив 20x, 0,45 NA, который является частью платформы скрининга с высоким содержанием, используемой в этом протоколе.
ПРИМЕЧАНИЕ: 20-кратный объектив представляет собой хороший компромисс между разрешением изображения, детализацией и скоростью сбора, необходимой для фиксации изменений АФК с течением времени. Можно выбрать объективы с более высоким увеличением (например, 40X), однако это приведет к увеличению времени захвата. - Укажите настройки экспозиции камеры для получения изображений, такие как время экспозиции, объединение камеры и интервал z-стека, в соответствии с конкретными требованиями протокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции (часто в миллисекундах) варьируется в зависимости от уровня сигнала и чувствительности конкретных используемых флуорофоров. Это также может незначительно отличаться от эксперимента к эксперименту в зависимости от концентрации красителя и качества окрашивания. В действующем протоколе параметры захвата зафиксированы следующим образом - Целевой % - 35%, режим получения изображения - 1104 x 1104 (с биннингом 2x2), а объектив 20x, 0,45 NA. Эти параметры могут быть заданы в соответствии с конкретными условиями эксперимента.
- В системе визуализации HCS откройте режим Target Activation (Активация мишени) в интерфейсе Cellomics bio-applications (Биоприложения Cellomics) и создайте новый протокол с использованием двухканального протокола настройки, совместимого с (а) ядерным окрашиванием и (б) сбором данных флуоресцентного зонда DHE. В действующем протоколе фильтры 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS и 386_BGS_RS использовались для (а) ядерного окрашивания Hoechst 33342, (б) общего производства АФК и (в) обнаружения супероксидных радикалов, соответственно. Выбор этих фильтров был обусловлен специфическим перекрытием эмиссионных свойств каждого красителя (DAPI и DHE), используемых в рамках этого протокола.
- Параметры конфигурации образа
ПРИМЕЧАНИЕ: После настройки параметров изображения можно запустить процесс сбора изображений с помощью программного интерфейса.- Параметры коллекции изображений
- Идентификация основного интересующего объекта слежения (ядра клеток) с помощью различных алгоритмов, доступных в приборе (оптика - изоданные, фиксированные и треугольные).
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе используется метод изоданных для идентификации и маркировки первичного объекта. - Сегментируйте объект (если таковой имеется) по форме или параметру интенсивности.
- Проверьте первичный объект на основе требуемых параметров размера, формы и интенсивности, уникальных для каждого типа ячейки.
- Затем определите «область интереса» (ROI) вокруг этого основного объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: ROI является ключевым параметром сбора данных, который определяет место, где интенсивность флуоресцентного красителя определяется как постоянная и воспроизводимая для разных типов клеток. ROI определяет ключевые параметры (например, интенсивность красителя), которые измеряются для каждого первичного объекта слежения (т.е. ячейки) в разных каналах прибора. ROI может быть определен в виде круга или кольца вокруг ядра каждой клетки. Программное обеспечение HCS автоматически получает интенсивность маркера флуоресцентного красителя DHE в канале 2 в пределах ROI для каждой клетки, которая сегментируется и анализируется в автоматическом режиме. - Установите круг размером 20 мкм вокруг первичного объекта (ядра). Расстояние 20 мкм было выбрано в этом исследовании на основе приблизительных размеров различных клеточных линий, используемых в этом протоколе (HepG2, JHH-4 и HUH-7). Кольцевая ROI 20 мкм вокруг клеток позволила получить интенсивность флуоресценции последовательным и воспроизводимым образом.
ПРИМЕЧАНИЕ Ключевым параметром при выборе ROI является возможность адекватного покрытия площади ячейки; размер кругового ROI зависит от размера ячейки. Для более крупных ячеек может потребоваться более высокая рентабельность инвестиций, и наоборот для более низкой рентабельности инвестиций. Эти параметры должны быть определены заранее для каждого интересующего типа клеток и флуоресцентного красителя.
- Идентификация основного интересующего объекта слежения (ядра клеток) с помощью различных алгоритмов, доступных в приборе (оптика - изоданные, фиксированные и треугольные).
- Параметры коллекции изображений
- Характеристика генеральной совокупности и выбор признаков для хранения
- После того, как различные параметры сбора данных определены в протоколе визуализации HCS, переведите систему HCS в режим сбора данных.
- Параметры получения изображений для этого протокола были установлены следующим образом: ограничение сканирования 1000 ячеек/лунку, с минимальным требованием 10 объектов (ячеек) на поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество оцененных месторождений для каждой скважины было определено на основе окончательного количества ячеек, достигших числа 1000. Система HCS продолжает поиск в различных местах в скважине до тех пор, пока не получит целевую популяцию в 1000 клеток на лунку. Таким образом, скорость сбора данных зависит от слияния и общего количества ячеек, присутствующих в каждой лунке 96-луночной пластины. В соответствии с текущим протоколом, общая и средняя интенсивность канала 2 (представляющая собой супероксидные радикалы и общую добычу АФК) была собрана из каждой скважины для дальнейшего анализа.
- Захват, обработка и анализ изображений
- После настройки и окончательной настройки параметров получения изображения запустите процесс сканирования для каждой 96-луночной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации Cellomics CX7 обеспечивает скрининг с высоким содержанием и автоматизированный анализ образцов по различным параметрам, включая производство АФК в клетках с высокой пропускной способностью. В дополнение к производству АФК, система HCS способна предоставить дополнительную ценную информацию о различных параметрах, таких как морфология клеток, субклеточная локализация и многие другие интересующие клеточные особенности. После оптимизации для сбора данных платформа визуализации HCS позволяет проводить всестороннюю, качественную и количественную характеристику параметров клеток надежным образом. - После завершения процесса сканирования запустите программное обеспечение View Analysis и экспортируйте различные количественные параметры данных в .csv формате для дополнительного анализа.
- Используя стороннее программное обеспечение, скопируйте и вставьте различные интересующие количественные значения для дополнительного последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем протоколе программное обеспечение GraphPad Prism использовалось для анализа значений интенсивности DHE в ответ на индуцированный окислительный стресс, вызванный воздействиемH2O2и менадиона.
- После настройки и окончательной настройки параметров получения изображения запустите процесс сканирования для каждой 96-луночной пластины.
- Анализ данных и статистики
- Вычислите среднюю интенсивность канала 2 (представляющую суммарные значения АФК и супероксидные радикалы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты по расчету значений интенсивности были повторены три раза с 6 повторениями для каждого условия на каждом уровне дозирования. - Выполните односторонний ANOVA или t-критерий для измерения различий в значениях интенсивности между различными условиями испытания.
- Вычислите среднюю интенсивность канала 2 (представляющую суммарные значения АФК и супероксидные радикалы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дигидроэтидий (ДГЭ) представляет собой супероксид-чувствительный флуоресцентный краситель, который предоставляет специфическую информацию о внутриклеточных состояниях АФК. Краситель DHE по своей природе излучает синюю флуоресценцию в цитоплазме. Однако при взаимодействии с супероксидными радикалами он превращается в 2-гидроксиетидий, который излучает флуоресценцию в красном диапазоне длин волн (>550 нм) (рис. 1). Краситель DHE легко транспортируется в клетки и ядро. Излучаемая флуоресценция может быть визуализирована с помощью установки флуоресцентной микроскопии, широко доступной во многих лабораториях. В текущем исследовании полезность красителя DHE на нескольких клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы - клетках HUH7, JHH4 и HepG2 в качестве зонда генерации видов АФК была проверена на скрининговой платформе с высоким содержанием. Клетки обрабатывали двумя агентами, генерирующими АФК - (а) перекисью водорода и (б) менадионом в течение 30 мин дозозависимым способом (см. Рисунок 2 и Рисунок 3 для получения подробной информации о дозировке), чтобы индуцировать окислительный стресс в клетках с последующим мечением красителем ДГЭ в 96-луночной планшете. КакH2O2 , так и менадион резко увеличивали интенсивность флуоресценции во всех трех клеточных линиях дозозависимым образом. Используя алгоритмы сегментации и количественного определения изображений в рамках высокопроизводительной платформы скрининга, интенсивность флуоресценции АФК, индуцированной АФК, была количественно определена в 1000 клеток на лунку в шести репликатах. Были измерены три независимые реплики, а результаты агрегированы и проанализированы. Ядерное окрашивание Hoechst 33342 играет важную роль в идентификации плоскости, в которой адгезивные клетки присутствуют в каждой лунке. Кроме того, флуоресценция 2-OH-E+ и E+ может быть обнаружена как в ядре, так и в цитоплазме тестируемых клеток соответственно на высокопроизводительной скрининговой платформе (см. рис. 4).
ВоздействиеH2O2 приводило к статистически значимому увеличению флуоресценции, индуцированной АФК, по всем клеточным линиям, анализируемым дозозависимым образом (см. рис. 2; нижняя панель). Однако такой дозозависимый ответ не наблюдался в случае воздействия менадиона. При применении менадиона клеточная линия JHH4 демонстрировала дозозависимое увеличение интенсивности флуоресценции, в то время как в клеточных линиях HepG2 и HUH7 значимая разница в интенсивности флуоресценции наблюдалась только при более высоких концентрациях менадиона (см. рис. 3; нижняя панель). Эти различия в реакциях генерации АФК могут быть обусловлены различными механизмами продукции АФК H2O2 и менадиона. В то время как H2O2 запускает образование АФК в клетках более прямым образом (например, через действие антиоксидантных ферментов, таких как пероксидазы и каталазы), предполагается, что менадион генерирует виды АФК косвенным образом через индуцированную митохондриальную дисфункцию. Из-за непрямого механизма выработки АФК флуоресценции ДГЭ может потребоваться больше времени для проявления менадиона. Эти результаты указывают на то, что АФК-зависимая флуоресценция DHE чувствительна к продолжительности воздействия окислительного стресса, концентрации и типам клеток. Таким образом, оптимизация протокола эксперимента для каждого уникального типа клеток является обязательной. Что еще более важно, этот протокол демонстрирует возможность использования красителя DHE в качестве агента для обнаружения АФК высокопроизводительным способом, что может быть использовано в таких областях, как токсикология, биология рака и скрининг лекарств.
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая пути окислительного превращения молекулы флуоресценции DHE в 2-гидроксиетидий (2-OH-E+) и этидий (E+) соответственно. Спектры флуоресцентного излучения 2-OH-E+ и E+ перекрываются при возбуждении 480 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработка перекисью водорода повышает внутриклеточные уровни АФК дозозависимым образом. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы - (A) HUH7, (B) JHH4 и (C) HepG2 обрабатывалиH2O2 в дозах 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1000 мкМ в течение 30 мин. Клетки окрашивали красителем DHE (10 мкМ) в питательной среде в течение дополнительных 30 мин, после чего проводили ядерное окрашивание по Hoechst 33342. Всего в каждой скважине было насчитано 1000 клеток. Линейное, дозозависимое увеличение флуоресценции ДГЭ наблюдается по всем трем клеточным линиям (верхняя панель). Статистически значимое увеличение флуоресценции наблюдается во всех клеточных линиях при дозировании 500 мкМ и выше (нижняя панель). Каждый набор данных представляет собой среднее значение шести реплик в 96-луночном планшете, полученных в результате трех независимых экспериментов (n = 3). Условия обработки сравнивали с необработанными образцами с помощью одностороннего теста ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; масштабная линейка изображения - 50 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Лечение менадионом повышает внутриклеточные уровни АФК дозозависимым образом. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы - (A) HUH7, (B) JHH4 и (C) HepG2 обрабатывали менадионом в дозах 25 мкМ, 50 мкМ, 75 мкМ и 100 мкМ в течение 30 мин. Клетки окрашивали красителем DHE (10 мкМ) в питательной среде в течение дополнительных 30 мин, после чего проводили ядерное окрашивание по Hoechst 33342. Всего в каждой скважине было насчитано 1000 клеток. Линейное, дозозависимое увеличение флуоресценции ДГЭ наблюдается по всем трем клеточным линиям (верхняя панель). Статистически значимое увеличение флуоресценции наблюдается последовательно при максимальной дозе (100 мкМ; нижняя панель). Вариабельность наблюдается для остальных доз менадионов в разных клеточных линиях (JHH4 > HUH7 > HepG2). Каждый набор данных представляет собой среднее значение шести реплик в 96-луночном планшете, полученных в результате трех независимых экспериментов (n = 3). Условия обработки сравнивали с необработанными образцами с помощью одностороннего теста ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; масштабная линейка изображения - 50 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Флуоресценция одноклеточного ДГЭ - Крупный план изменений флуоресценции ДГЭ, наблюдаемых после обработки (А) перекисью водорода и (В) менадионом в течение 30 минут. Цитоплазматические и ядерные изменения флуоресценции ДГЭ наблюдаются в различных клетках. Также видна автоматическая маска сегментации, генерируемая платформой скрининга с высоким содержанием контента. Масштабная линейка изображения - 10 мкм. Увеличение – 20х. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Визуализация флуоресценции DHE, управляемой супероксидом, в ответ на перекись водорода. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы - (A) HUH7, (B) JHH4 и (C) HepG2 обрабатывалиH2O2 в дозах 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1000 мкМ в течение 30 мин. Затем клетки окрашивали красителем DHE (10 мкМ) в питательной среде в течение дополнительных 30 минут. Затем клетки подсвечивали светодиодом с длиной волны 386 нм, а флуоресцентную визуализацию собирали на длине волны >560 нм. Ядерное противоокрашивание не проводилось, чтобы избежать спектральных перекрестных помех. Дозозависимое увеличение флуоресценции ДГЭ наблюдается при дозах > 500 мкМ. Ожидается, что флуоресценция ДГЭ с УФ-подсветкой обусловлена большей частью образования супероксидных радикалов. Каждый набор данных представляет собой среднее значение шести реплик в 96-луночном планшете, полученных в результате двух независимых экспериментов (n = 2). Условия обработки сравнивали с необработанными образцами с помощью одностороннего ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; масштабная линейка изображения - 50 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Визуализация флуоресценции DHE, управляемой супероксидом, в ответ на менадион - Клетки гепатоцеллюлярной карциномы - (A) HUH7, (B) JHH4 и (C) HepG2 обрабатывали менадионом в дозах 25 мкМ, 50 мкМ, 75 мкМ и 100 мкМ в течение 30 мин. Затем клетки окрашивали красителем DHE (10 мкМ) в питательной среде в течение дополнительных 30 минут. Как и в случае с перекисью водорода, наблюдалось дозозависимое увеличение флуоресценции ДГЭ. Каждый набор данных представляет собой среднее значение шести реплик в 96-луночном планшете, полученных в результате двух независимых экспериментов (n = 2). Условия обработки сравнивали с необработанными образцами с помощью одностороннего ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; масштабная линейка изображения - 50 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, доступных в литературе, используют DCFH-DA в качестве флуоресцентного зонда для количественного определения видов АФК. Тем не менее, многочисленные исследования показали, что DCFH-DA не является идеальным зондом для измерения внутриклеточных АФК. Различные причины, постулируемые для непригодности DCFH-DA в качестве зонда, включают: (i) DCFH-DA не проявляет прямой реакции сH2O2, что делает его неподходящим красителем для оценки внутриклеточного уровняH2O2. (ii) Некоторые одноэлектронные окисляющие вещества, такие как OH, NO2 и ONOO-, окисляют DCFH до DCF. (iii) переходные металлы, цитохром С и гемпероксидаза могут способствовать окислению DCFH в присутствии кислорода иH2O2. (iv) Наиболее важно то, что DCFH-DA производит промежуточный продукт DCFH.-/DCF., который в присутствии кислорода индуцирует образование дополнительного супероксида. Дисмутация сO2.- генерирует дополнительныйH2O2, что может привести к искусственному увеличению интенсивности флуоресценции и ошибочно повышенным уровням АФК. Многие авторы считают использование DCFH-DA в качестве ненадежного флуоресцентного зонда для обнаружения внутриклеточногоH2O2и других видов АФК 8,9,10,11,12,13,14.
В отличие от DCFH-DA, DHE специфически реагирует с супероксидным радикалом, что приводит к образованию флуоресцентного продукта, 2-гидроксиетидия (2-OH E+). Несупероксидные АФК также могут реагировать с ДГЭ с образованием второго флуоресцентного продукта, этидия (E+). В то время как спектры флуоресценции 2-OH-E+ и E+ относительно похожи, эти две молекулы представляют собой конечные продукты специфических взаимодействий между внутриклеточными видами АФК и ДГЭ и отвечают за общую интенсивность флуоресценции, наблюдаемую в клетках из-за окислительного стресса. Некоторые исследования показали, что селективное возбуждение на более коротких длинах волн УФ-диапазона (<400 нм) может быть более специфичным для возбуждения 2-ОН этидия (в отличие от E+) и, таким образом, для образования супероксидных радикалов 7,12,14. Это было оценено путем возбуждения клеток только светодиодным светом с длиной волны 386 нм. По сравнению с возбуждением с длиной волны 480 нм на длине волны 560 нм наблюдалось снижение интенсивности излучения (см. дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2). Тем не менее, нельзя быть уверенным в том, что это связано исключительно с флуоресценцией 2-OH Ethidium и представляет собой потенциальный недостаток текущего подхода. Другие исследования показали, что УФ-возбуждение (например, 386 нм) также может приводить к одновременному флуоресцентному излучению этидия, хотя и на более низких уровнях по сравнению с 2-ОН этидием 7,15. Несмотря на это, наш протокол определяет ДГЭ как лучшую альтернативу красителю для измерения количественных различий в большинстве внутриклеточных АФК с использованием системы визуализации и скрининга с высоким содержанием.
Постулируется отсутствие промежуточных драйверов генерации АФК (таких как в DCFH-DA) как основное преимущество при использовании ДГЭ для оценки внутриклеточной продукции АФК. Однако этот механизм флуоресценции ДЭ еще не установлен окончательно. В тех случаях, когда необходимо точное количественное определение уровней АФК, рекомендуется использовать дополнительные ортогональные методы количественной валидации, такие как ВЭЖХ и/или методы жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) для точной оценки уровней 2-OH-E+ в клетках 8,9,13. Однако следует знать, что методы ВЭЖХ и ЖХ-МС обязательно предполагают агрегацию и солюбилизацию клеток для оценки. Таким образом, пространственно-временная информация, закодированная в флуоресцентном методе визуализации, как в текущем протоколе, будет потеряна при ВЭЖХ и ЖХ-МС и представляет собой основное преимущество методов оценки АФК, основанных на визуализации. Дополнительным преимуществом флуоресценции ДГЭ с красным смещением является то, что более длинноволновый свет (красный) менее токсичен для клеток из-за меньшей энергии, переносимой красным светом.
Дозозависимая природа флуоресценции ДГЭ для измерения относительных внутриклеточных изменений АФК была проверена с использованием менадионов и перекиси водорода в качестве индукторов окислительного стресса. Менадион и перекись водорода были выбраны в качестве испытуемых веществ из-за вариабельных механизмов генерации АФК и окислительного стресса20,21. В то время как выработка АФК из-за воздействия менадиона является косвенной (через митохондриальную дисфункцию), H2O2 вызывает окислительный стресс более прямым образом. Увеличение концентрации менадионов приводило к усилению флуоресценции ДГЭ линейным, воспроизводимым и дозозависимым образом. Подобно менадиону,Н2О2является хорошо известным индуктором АФК, способным генерировать гидроксильные радикалы (ОН) через химию Фентонапрямым образом 22. Линейный и дозозависимый ответ также наблюдался при флуоресценции ДГЭ из-за воздействияH2O2. Из-за селективности ДГЭ именно к супероксидному радикалу, он не вступает в прямую реакцию сН2О2. Вместо этого образующиеся внутриклеточные супероксидные радикалы первоначально реагируют с H2O2 с образованием вторичных форм АФК, таких как гидроксирадикалы, посредством реакций Габера-Вейса и Фентона, которые затем обнаруживаются флуоресценцией DHE23. Спектр флуоресцентного излучения ДГЭ в ответ на два различных окисляющих вещества путем измерения большей части внутриклеточной продукции АФК установлен в действующем протоколе 8,13. Эти результаты подтверждают полезность флуоресцентного красителя DHE в качестве лучшей альтернативы для обнаружения и количественной оценки внутриклеточных уровней АФК с использованием высокопроизводительных подходов скрининга.
Превосходная селективность, чувствительность и оптические свойства ДГЭ делают его ценной альтернативой для исследования образования АФК и окислительного повреждения высокопроизводительным способом, как установлено в текущем протоколе. Будущие исследования в нашей лаборатории будут изучать роль ДГЭ в качестве маркера АФК в перекрестной реактивности между АФК и клеточными сигнальными механизмами при различных физиологических и патологических состояниях в условиях высокой пропускной способности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
РК и RRG были поддержаны грантом Центра металлов в биологии и медицине UNM (CMBM) через грант NIH NIGMS P20 GM130422. RRG была поддержана пилотной премией из гранта NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Поддержка ядра визуализации для инструмента CX7 Cellomics была обеспечена через ядра центра AIM, финансируемые грантом NIH P20GM121176. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Шарину Десаи и д-ра Ли Чена за их неоценимую помощь в решении технических вопросов, связанных с использованием платформы визуализации CX7 Cellomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
