Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray
Summary
Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine,<em> P. taeda</em>, En andere naaldbomen. Hier tonen we pre-en post-hybridisatie hanteren en wassen technieken die gebruikt kunnen worden met deze array betere consistentie, verminderde artefacten, en een lagere opbrengst achtergronden.
Abstract
PtGen2 is een kenmerk 26496 cDNA microarray met versterkte loblolly grenen EST's. De array wordt geproduceerd in ons laboratorium voor gebruik door onderzoekers bestuderen van genexpressie in dennen en andere naaldbomen. PtGen2 werd ontwikkeld als een resultaat van onze ontdekking van genen inspanningen in loblolly grenen, en bestaat uit sequenties geïdentificeerd in de eerste plaats van de wortel weefsels, maar ook van de naald en de stengel. 1,2 PtGen2 is getest door het hybridiseren van verschillende gelabelde Cy-dye conifeer doel cDNA , waarbij zowel versterkt en niet-versterkte indirecte labeling methoden, en ook getest met een aantal van de hybridisatie en het wassen voorwaarden. Deze video richt zich op de behandeling en verwerking van dia's voor en na de pre-hybridisatie, als na hybridisatie, met behulp van enkele aanpassingen aan de procedures eerder ontwikkelde. 3,4 Ook inbegrepen, in tekst vorm, zijn de protocollen die gebruikt worden voor het opwekken, etikettering en de clean-up van de doelstelling cDNA's, evenals informatie over de software die wordt gebruikt voor de downstream-verwerking van gegevens.
PtGen2 is bedrukt met een eigen afdruk buffer die hoge concentraties van het zout dat kan moeilijk zijn om volledig te verwijderen bevat. De dia's worden eerst gewassen in een warme SDS-oplossing voorafgaand aan de pre-hybridisatie. Na de pre-hybridisatie, worden de dia's krachtig gewassen in een aantal wijzigingen van het water om de verwijdering van de resterende zouten te voltooien. LifterSlips ™ worden vervolgens gereinigd en geplaatst op de dia's en gelabeld cDNA wordt zorgvuldig geladen op de microarray door middel van capillaire werking, die voorziet in een gelijkmatige verdeling van de steekproef over de glijbaan, en vermindert de kans van de zeepbel van oprichting. Hybridisatie van doelstellingen om de array wordt gedaan bij 48 ° C in een hoge luchtvochtigheid. Na hybridisatie wordt een reeks van standaard wasbeurten gedaan op 53 ° C en kamertemperatuur voor langere tijden. Verwerking PtGen2 dia's met deze techniek minder zout en SDS-afgeleide artefacten vaak gezien als de array is minder rigoureus verwerkt. Hybridiserende doelen die afgeleid zijn uit verschillende bronnen conifeer RNA, deze verwerking protocol leverde minder artefacten, minder achtergrond, en op voorwaarde dat een betere samenhang tussen de verschillende experimentele groepen van arrays.
Protocol
Discussion
PtGen2 is een recent ontwikkeld, op maat cDNA microarray, dat is ontworpen om in de eerste plaats worden gebruikt door de loblolly dennen onderzoeksgemeenschap. Generated voorlopige resultaten tot nu toe hebben aangetoond dat het array een waardevol instrument voor de evaluatie van transcriptionele gebeurtenissen die zich voordoen in respons op droogtestress, evenals bij het toezicht op wijzigingen die tijdens de ontwikkeling van het embryo zich in de maritieme dennen, Pinus pinaster 5,6 We wor…
Acknowledgements
De etikettering, hybridisatie en het wassen van protocollen hierin bevatten enkele wijzigingen die eerder ontwikkeld door Dr J. Quackenbush terwijl bij het Institute for Genomic Research (TIGR), Dr Shawn Levy aan de Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR), en Dr rob Alba terwijl het Boyce Thompson Instituut, (BTI) Cornell University.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Otro | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Otro | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Otro | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
Referencias
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
