ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理
Summary
cDNAマイクロアレイPtGen2は、テーダマツの遺伝子発現研究のために開発されました<em> P. taeda</em>、および他の針葉樹種。ここで、我々は、事前に、より良い一貫性をもたらすためにこの配列で使用できるテクニックを処理し、洗浄後、ハイブリダイゼーション、削減の成果物、および低バックグラウンドを示す。
Abstract
PtGen2は増幅さテーダマツのESTを含む26496機能cDNAマイクロアレイです。配列は、松や他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者による使用のために我々の研究室で生産されている。 PtGen2は、テーダマツにおける私たちの遺伝子の発見の努力の結果として開発され、主に根の組織からだけでなく、針と幹から同定された配列で構成されています。1,2 PtGen2は異なるのCy -色素標識された針葉樹のターゲットcDNAをハイブリダイズすることによりテストされています、増幅および間接標識法を非増幅し、また、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の数とテストの両方を使用する。このビデオでは、以前に開発された手続きに多少の変更を使用して、プレハイブリダイゼーション前後だけでなく、ハイブリダイゼーション後のスライドの取り扱いおよび処理に焦点を当てています。3,4また、発電に使用されるプロトコルである、テキスト形式でのみ、付属のラベリングとターゲットcDNAのsのクリーンアップだけでなく、ソフトウェアの詳細については、ダウンストリームデータ処理のために使用。
PtGen2は完全に除去することが困難な場合も塩の高濃度が含まれている独自のプリントバッファに出力されます。スライドは、プレハイブリダイゼーションの前に暖かいSDS溶液で最初に洗浄されています。プレハイブリダイゼーション後、スライドは、残りの塩の除去を完了するために水のいくつかの変化に積極的に洗浄されています。 LifterSlips™は、その後洗浄し、スライド上に配置し、標識cDNAされるかは、慎重にスライド全体のサンプルを均等に分散のために提供する毛細管現象の方法によりマイクロアレイ上に装填し、気泡の取り込みの可能性を減少させる。配列へのターゲットのハイブリダイゼーションは48℃で高湿度の条件で行われます。ハイブリダイゼーションの後、標準的な一連の洗浄は53℃の拡張時間のためのCおよび室温で行われている。このテクニックを使用して処理PtGen2スライドは、塩と、配列が少ない厳密に処理されるときにしばしば見られるSDS -由来のアーチファクトを低減します。いくつかの異なる針葉樹RNAのソースから派生したターゲットをハイブリダイズする、この処理のプロトコルは、より少ないアーティファクト、減少の背景を生み出し、そして配列の異なる実験群間でより良い整合性を提供する。
Protocol
Discussion
PtGen2は、テーダマツの研究コミュニティで主に使用するように設計されて最近開発された、カスタムcDNAマイクロアレイです。これまでに生成された予備的な結果は、我々が持っている乾燥ストレスに応答して発生する転写事象の評価に有用なツールであることが配列を示すだけでなく、海岸松の胚発生中に発生した変更を監視するには、 マツカイガンショウ 5,6きたまた、最?…
Acknowledgements
ラベリング、ハイブリダイゼーション、および洗浄プロトコールは、ここにゲノム研究所（TIGR）の間、博士J.クアッケンブッシュが以前に開発されたものに若干の変更、ヴァンダービルトマイクロアレイ共有リソース（VMSR）、博士博士ショーンレヴィが含まれていますロブアルバボイストンプソン研究所、（BTI）コーネル大学在学中。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Otro | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Otro | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Otro | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
Referencias
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
