Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray
Summary
КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна,<em> П. taeda</em>, И других хвойных пород. Здесь мы покажем, пре-и пост-гибридизация обработки и мытья методов, которые могут быть использованы с этого массива для получения лучшей консистенции, снижение артефактов, и нижний фон.
Abstract
PtGen2 это 26496 особенность кДНК микрочипов содержащие усиливается ЭБТ ладанной сосны. Массива производится в нашей лаборатории для исследователей изучения экспрессии генов в сосны и других хвойных пород. PtGen2 была разработана как результат наших генов открытие усилия в ладанной сосна, и состоит из последовательности определены в основном из ткани корней, но и от иглы и стебля. 1,2 PtGen2 была проверена путем гибридизации различных Су-красителя помечены кДНК хвойных целевой , используя как усиливается и без усилителей косвенных методов маркировки, а также протестированы с числом гибридизации и стиральные условиях. Это видео фокусируется на обработке и переработке слайды до и после предварительной гибридизации, а также после гибридизации, используя некоторые изменения в процедуры, разработанные ранее. 3,4 Также, в текстовом виде только в протоколах, используемых для производства, маркировки и очистки целевых кДНК с, а также информацию о программном обеспечении, используемом для последующей обработки данных.
PtGen2 печатается с собственной буфера печати, содержит высокую концентрацию солей, которые могут быть трудно удалить полностью. Слайды промывают сначала в теплом растворе SDS до предварительно гибридизации. После предварительного гибридизации, слайды моют энергично в нескольких сменах воды до полного удаления оставшихся солей. LifterSlips ™ затем очищается и устанавливается на слайды и помечены кДНК тщательно загружены на микрочипов путем капиллярного действия, который предусматривает равномерное распределение по всей образец слайдов, а также снижает шансы пузырь регистрации. Гибридизация целей для массива осуществляется на 48 ° C в условиях повышенной влажности. После гибридизации серии стандартных моет выполняются на 53 ° C и комнатной температуре в течение длительного времени. Обработка PtGen2 слайды с помощью этой техники уменьшает соль и SDS-производные артефакты часто видел, когда массив обрабатывается менее строго. Гибридизации цели основе нескольких различных хвойных источников РНК, эта обработка протокола дали меньше артефактов, снижение фона, и обеспечивает более полный согласованности между различными экспериментальными группами массивов.
Protocol
Discussion
PtGen2 является недавно разработанный, пользовательские кДНК микрочипов, который был предназначен для использования прежде всего научного сообщества сосны ладанной. Предварительные результаты, полученные к настоящему времени показали, массив будет ценным инструментом в оценке транск?…
Acknowledgements
Маркировки, гибридизации, и стиральная протоколов, содержат некоторые изменения, разработанные ранее д-ром Дж. Квакенбуш в то время как института геномных исследований (ТИГР), доктор Шон Леви в Вандербильта Microarray общему ресурсу (VMSR), и д-р Роб Альба в то Бойс Томпсон институт (БТИ) Корнельского университета.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Otro | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Otro | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Otro | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Otro | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
Referencias
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D’Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).
