研究有丝分裂的显微注射技术果蝇合胞体胚胎
Summary
本协议描述了利用显微注射和高分辨率成像<em>果蝇</em合胞体胚胎研究有丝分裂。
Abstract
本协议描述了果蝇合胞胚胎的研究有丝分裂 1的使用 。果蝇有用的基因序列的基因组，它可以很容易地维护和操纵。许多有丝分裂突变体的存在，并且已经和正在产生荧光表达功能（如GFP）的转基因果蝇 – 标记的有丝分裂的蛋白质。有针对性的基因表达是可以使用GAL4/UAS系统2。
果蝇的早期胚胎进行多个有丝分裂非常迅速（细胞周期的持续时间，≈10分钟）。它非常适合成像有丝分裂，因为在周期10-13，原子核分裂迅速，不干预在胚胎表面胞质在下方的皮质单单层同步。这些迅速分裂的细胞核可能使用其他细胞的有丝分裂机械，但他们对速度进行了优化;检查点一般认为不严格，允许的情况下会导致细胞周期阻滞细胞具有较强的检查站有丝分裂蛋白的研究。胚胎表达绿色荧光蛋白标记的蛋白或注射荧光标记的蛋白质，可以很容易地成像遵循生活动态（图1）。此外，显微注射胚胎可以阻断功能的特定蛋白的抗体或抑制剂， 研究其功能3的损失或扰动的影响。这些试剂可以弥漫整个胚胎，达成许多纱锭产生抑制剂的浓度梯度，而这反过来导致在一个渐变的突变的等位基因系列相媲美的缺陷。理想的情况下，如果目标蛋白的荧光标记，抑制梯度可以直接可视化4。据推测，最强的表型是空的表型相媲美，虽然这是很难正式排除这样的可能性，该抗体可能有在极少数情况下，如此严格的控制和谨慎的解释占主导地位的影响，必须应用。进一步远离注射部位，蛋白质的功能是只有部分丧失使靶蛋白的其他功能才能显现。
Protocol
Discussion
此协议相对简单，但是，每一步都需要练习，以确保胚胎不被损坏。总是需要做的工作，以确保获得可靠的结果，正在认真对照实验。通过显微注射到缓冲区或若丹明微管蛋白表达GFP -微管蛋白的控制，以确保有丝分裂的收益，通过所有周期通常在胚胎表面（周期10至13）的胚胎开始，这是一个好办法。在控制胚胎，你不应该观察主轴之间的任何物理连接，这往往是导致过多脱水，所以较低的脱水?…
Acknowledgements
此协议是目前使用在我们的实验室，多年来一直细化很多人，包括博士大卫夏普，Mijung跆拳道，派翠吉雅Sommi，Dhanya Cheerambathur。我们感谢条例草案“沙利文博士（UCSC）提供优秀的意见，我们的操纵和早期果蝇胚胎显微注射时，我们在这个系统中的工作正在启动（注释13 ）。我们感谢所有成员的Scholey实验室。我们在果蝇有丝分裂的工作是由美国国立卫生研究院授予GM55507支持。
Referencias
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
