Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in de<em> Drosophila melanogaster</em> Syncytieel embryo mitose te bestuderen.
Abstract
Dit protocol beschrijft het gebruik van de Drosophila melanogaster syncytieel embryo's voor het bestuderen van mitose 1. Drosophila is nuttig genetica met een gesequenced genoom, en kan eenvoudig worden onderhouden en gemanipuleerd. Veel mitotische mutanten bestaan, en transgene vliegen uiten van functionele fluorescent (bijv. GFP) – tagged mitotische eiwitten zijn en worden gegenereerd. Gerichte genexpressie is mogelijk met de GAL4/UAS systeem 2.
De Drosophila vroege embryo voert meerdere mitoses zeer snel (celcyclus duur, ≈ 10 min). Het is zeer geschikt voor de beeldvorming mitose, want tijdens de cycli 10-13, kernen verdelen snel en synchroon zonder in te grijpen cytokinese op het oppervlak van het embryo in een monolaag net onder de cortex. Deze snel delende kernen waarschijnlijk gebruik maken van dezelfde machines als mitotische andere cellen, maar ze zijn geoptimaliseerd voor snelheid, het ijkpunt wordt algemeen aangenomen dat niet te streng, waardoor de studie van de mitotische eiwitten wier afwezigheid zou de celcyclus veroorzaken in cellen met een sterke checkpoint . Embryo's uitdrukken GFP gelabelde eiwitten of gemicroinjecteerd met fluorescent gelabelde eiwitten kunnen eenvoudig worden gescand om te leven dynamiek (fig. 1) te volgen. Daarnaast kunnen embryo's worden gemicroinjecteerd met functie-blokkerende antilichamen of remmers van specifieke eiwitten om het effect van het verlies of verstoring van hun functie 3 studie. Deze reagentia kan diffunderen door het embryo, het bereiken van een groot aantal spindels met een helling van de concentratie van de remmer, die op zijn beurt resulteert in een gradiënt van gebreken die vergelijkbaar zijn met een allelische reeks van mutanten. Productie In het ideale geval als het doel eiwit fluorescent gelabeld is, kan de gradiënt van remming direct gevisualiseerd 4. Aangenomen wordt dat de sterkste fenotype is vergelijkbaar met de nul-fenotype, ook al is het moeilijk om formeel uitgesloten dat de antilichamen kunnen dominante effecten in zeldzame gevallen, zo strenge controle en voorzichtige interpretatie hebben moeten worden toegepast. Verder weg van de plaats van injectie, eiwit-functie is slechts gedeeltelijk verloren gaat waardoor andere functies van het doelwit eiwit aan zichtbaar worden.
Protocol
Discussion
Dit protocol is relatief eenvoudig, maar elke stap de praktijk nodig heeft om te zorgen dat de embryo's niet beschadigd zijn. Een zorgvuldige controle-experimenten moeten altijd worden gedaan om ervoor te zorgen dat betrouwbare resultaten worden verkregen. Een goede manier om dit te beginnen is door microinjecting buffer of rhodamine tubuline in de controle-embryo's uiten van GFP-tubuline om ervoor te zorgen dat de mitose normaal verloopt door alle cycli bij de embryo oppervlak (cycli 10 tot en met 13). In contr…
Acknowledgements
Dit protocol wordt momenteel gebruikt in ons laboratorium en is verfijnd door de jaren heen door vele mensen, waaronder Drs David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Wij danken dr. Bill Sullivan (UCSC) die ons voorzien van een uitstekend advies over de manipulatie en micro-injectie van vroege Drosophila embryo's bij ons werk op dit systeem werd geïnitieerd (ref. 13). Wij danken alle leden van de Scholey laboratorium. Ons werk op de mitose in Drosophila wordt ondersteund door NIH subsidie GM55507.
Referencias
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
