Techniques de microinjection pour l'étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial
Summary
Ce protocole décrit l'utilisation de micro-injection et l'imagerie à haute résolution dans le<em> Drosophila melanogaster</em> Embryon syncytial pour étudier la mitose.
Abstract
Ce protocole décrit l'utilisation de l'embryon de Drosophila melanogaster pour l'étude de la mitose syncytial 1. Drosophile a la génétique utile avec un génome séquencé, et il peut être facilement entretenu et manipulé. Il existe de nombreux mutants mitotique, et les mouches transgéniques exprimant fonctionnelle par fluorescence (par exemple GFP) – protéines mitotiques étiquetés ont été et sont générés. L'expression du gène ciblé est possible en utilisant le système GAL4/UAS 2.
La drosophile embryon précoce effectue mitoses multiples très rapidement (durée du cycle cellulaire, ≈ 10 min). Il est bien adapté pour l'imagerie de la mitose, parce que pendant les cycles de 10-13, les noyaux se divisent rapidement et de manière synchrone, sans intervenir cytokinèse à la surface de l'embryon dans une seule monocouche juste en dessous du cortex. Ces noyaux se divisent rapidement probablement utiliser la machinerie mitotique même que d'autres cellules, mais ils sont optimisés pour la vitesse, le checkpoint est généralement admis de ne pas être rigoureux, permettant l'étude des protéines mitotique dont l'absence entraînerait l'arrêt du cycle cellulaire dans les cellules avec un checkpoint forte . Embryons exprimant des protéines GFP étiqueté ou microinjectés avec des protéines marquées par fluorescence peut être facilement imagée de suivre la dynamique en direct (Fig. 1). En outre, les embryons peuvent être microinjectés avec fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de protéines spécifiques à étudier l'effet de la perte ou la perturbation de leur fonction 3. Ces réactifs peuvent diffuser dans tout l'embryon, atteignant plusieurs fuseaux pour produire un gradient de concentration de l'inhibiteur, ce qui entraîne à son tour dans un gradient de défauts comparables à une série allélique de mutants. Idéalement, si la protéine cible est marqué par fluorescence, le gradient d'inhibition peut être visualisé directement 4. Il est supposé que la plus forte phénotype est comparable à l'phénotype nul, mais il est difficile d'exclure formellement la possibilité que les anticorps peuvent avoir des effets dominante dans de rares cas, des contrôles afin rigoureuse et une interprétation prudente doit être appliquée. Plus loin du site d'injection, la fonction des protéines n'est que partiellement perdue permettant d'autres fonctions de la protéine cible à devenir évidents.
Protocol
Discussion
Ce protocole est relativement simple, cependant, chaque étape requiert la pratique de s'assurer que les embryons ne sont pas endommagés. Expériences de contrôle minutieux toujours besoin d'être fait pour s'assurer que des résultats fiables sont obtenus. Une bonne façon de commencer ce n'est par la micro-injection de tubuline tampon ou la rhodamine dans des embryons de contrôle exprimant la GFP-tubuline afin de s'assurer que la mitose se déroule normalement dans tous les cycles à la surface …
Acknowledgements
Ce protocole est actuellement utilisé dans notre laboratoire et a été affiné au fil des années par de nombreuses personnes, y compris les Drs David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia SOMMI, Dhanya Cheerambathur. Nous remercions le Dr Bill Sullivan (UCSC) qui nous a fourni d'excellents conseils sur la manipulation et la micro-injection d'embryons de drosophile tôt quand notre travail dans ce système a été lancé (réf. 13). Nous remercions tous les membres du laboratoire Scholey. Notre travail sur la mitose chez la drosophile est soutenu par NIH GM55507.
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