Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée)
Summary
Électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée est utilisée pour séparer l'ADN simple brin ou l'ARN jusqu'à une limite de 500 nucléotides. L'urée en combinaison avec des échantillons dénature la chaleur et non structurées brins simples migrer dans la matrice de gel en fonction de leur poids moléculaire.
Abstract
PAGE urée ou électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée emploie 6-8 M d'urée, qui dénature l'ADN secondaire ou structures d'ARN et est utilisé pour leur séparation dans une matrice de gel de polyacrylamide en fonction du poids moléculaire. Fragments de 2 à 500 bases, avec des différences de longueur aussi petite que d'un seul nucléotide, peuvent être séparés en utilisant cette méthode 1. La migration de l'échantillon est dépendante de la concentration d'acrylamide choisi. Un pourcentage plus élevé de polyacrylamide résout fragments de poids moléculaire plus faible. La combinaison de l'urée et des températures de 45-55 ° C pendant la course de gel permet la séparation de l'ADN non structurées ou des molécules d'ARN.
En général, cette méthode est nécessaire d'analyser ou de purifier l'ADN simple brin ou de fragments d'ARN, comme les oligonucléotides synthétisés ou étiquetés ou produits à partir des réactions de clivage enzymatique.
Dans cet article, vidéo, nous montre comment préparer et exécuter les gels de polyacrylamide dénaturant l'urée. Conseils techniques sont inclus, en plus des 1,2 protocole original.
Protocol
Discussion
- La netteté bande dépend de plusieurs facteurs. Le volume d'échantillon chargé pour les bandes pointus devrait être aussi petit que possible, c'est à dire idéalement entre 1-5 pl. Toutefois, jusqu'à 15 ul ne peut être chargé qui assure toujours une résolution acceptable. Moins de résultats volume d'échantillon plus nettes bandes.
- La qualité bande est également dépendant de l'épaisseur du gel. Diluant gels, tels que 0,75 mm montrent de meilleurs résultats que 1,5 mm d'épaisseur des gel…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le conseil de Singapour académique de recherche (ARC) [numéro de la subvention 90/07]. Nous remercions pour le soutien radiodurans.
Referencias
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- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. , (2001).
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