Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.
O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede independente com funções identificadas, capaz de executar comportamentos complexos em isolamento. Seus neurônios (10 a 25 m de diâmetro) são arranjados em plexos que se limitam a planos distintos da parede do intestino<sup> 1</sup>; Do plexo mioentérico podem ser encontrados entre as camadas musculares longitudinal e circular, eo plexo submucoso entre a camada muscular circular e da mucosa. Uma vez que os sistemas efetores para estes plexos (transporte de epitélio, as células endócrinas, elementos imunológico, vasos sanguíneos e músculo liso) também estão contidos dentro da parede do intestino, semi-intactas preparações podem ser dissecados que preservam os componentes individuais de diferentes vias reflexas. O comportamento dos sistemas efetores é controlado pelo plexos submucoso e mioentérico atuando em conjunto. Portanto, o conhecimento detalhado das interações sinápticas dentro e entre os gânglios, e de comunicação entre os plexos, é essencial para a compreensão da função gastrointestinal normal. A ENS, como um sistema nervoso intacto, é um modelo único experimental em que se pode correlacionar eventos moleculares e celulares com o comportamento elétrico da rede neuronal e suas saídas fisiológicas. Por causa da organização quase-bidimensional de sua plexos, a ENS é particularmente adequado para o estudo de redes neurais usando vários sites técnicas de gravação óptica que empregam corantes sensíveis à voltagem<sup> 2,7,8,9</sup>. Vamos ilustrar aqui o uso de um relativamente novo naphthylstyryl-piridínio corante (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> Que oferece múltiplas vantagens sobre seus antecessores, incluindo fototoxicidade muito baixa, baixa taxa de internalização, e estabilidade química notável. Quando usado em conjunto com uma câmera que permite sub-milissegundo tempo de resolução, este corante nos permite monitorar a atividade elétrica de todos os neurônios no campo de visão com uma resolução máxima espacial de ~ 2,5 mM-aumento de 100X. Com menor ampliação (10X ou 20X), o sacrifício de uma única célula de resolução é compensada por um ganho em perspectiva, revelando a complexidade do circuito inter-ganglionares.
Este protocolo foi escrito com dois objetivos em mente. O primeiro é convencer outros investigadores que, graças aos avanços tecnológicos muitas da década passada, a gravação ótica da atividade elétrica utilizando corantes sensíveis à tensão tornou-se um dos mais poderosos, metodologias confiáveis e acessíveis para o estudo de redes neuronais intacta, na verdade , poderia ser facilmente implementado, mesmo em um laboratório com recursos modestos. O segundo objetivo é promover o sistema nervoso ent?…
Gostaríamos de agradecer DA Coulter (CHOP) por nos permitir usar seu microscópio dois-fotão para adquirir as imagens 2-fótons mostrada no início do vídeo, e H. Takano por compartilhar conosco seus conhecimentos técnicos.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |