N -连接糖链的糖蛋白在哺乳动物细胞中的脉冲大通分析
Summary
我们描述了一种通过改变早期的生活后，其在哺乳动物细胞中合成的糖蛋白的N -连接聚糖分析方法。这是通过分析代谢标记聚糖，从糖蛋白和高效液相色谱法检查酶的释放脉冲追逐。
Abstract
扣押的GLC<sub> 3</sub>男<sub> 9</sub>葡萄糖<sub> 2</sub>易制毒化学寡糖在ER新生多肽是一种分泌蛋白的共同修改。虽然这种修改是在多种生物过程中有牵连的其他方面，它的功能不断涌现，其生产糖蛋白的质量控制和贩运的信号的作用最近的证据。因此，相关的N -连接聚糖及其加工的现象正在紧锣密鼓地调查。最近已开发的蛋白质组学分析的方法，大大提高了N -连接糖蛋白聚糖的特性。然而，他们并没有提供洞察入的糖链参与处理的动态。对于这一点，标签和使用脉冲追逐分析协议，通常是复杂的，并给予非常低的收益率。我们在这里介绍一个简单的方法代谢为N -连接寡糖的分离和分析。该协议是基于标签的细胞[2 -<sup> 3</sup> H]甘露糖，变性裂解和低聚糖的酶释放，无论是从利益特别是免疫沉淀蛋白质，或从远藤H和N -糖苷酶F分子过滤（Amicon），序贯疗法与一般的糖蛋白池。在这个方法中分离低聚糖的高效液相色谱分析的输入，它允许不同的糖链结构之间的歧视，包括他们的单糖单位的数量，作为一个单糖的决议。使用这种方法，我们能够研究后，在正常情况下的脉冲追逐下蛋白酶抑制高甘露糖总细胞糖蛋白的N -连接寡糖型材。这些配置文件进行了比较，从免疫沉淀ER相关的降解（ERAD）衬底上获得的。我们的研究结果表明，大多数的NIH 3T3细胞糖蛋白是相对稳定的，他们低聚糖大多是修剪到人<sub> 9-8</sub>葡萄糖<sub> 2</sub>。相反，不稳定的ERAD基板修剪到人<sub> 6-5</sub>葡萄糖<sub> 2</sub>和糖蛋白轴承这些物种的积累后，抑制蛋白酶体降解。
Protocol
以下协议的目的是为分析总糖蛋白或利益的特定糖蛋白的糖链。这个过程基本上是与整个协议内的几个改变这两种情况下相同。 对于N -连接聚糖代谢的标签需要使用哺乳动物细胞生长在一个90毫米，每个样品菜过夜subconfluent的文化（样本可能代表不同的时间点或治疗）。此协议是NIH 3T3细胞进行了优化。 饿死孵育5毫升新鲜配制的预热（37℃）葡萄糖的培养基，提供10％的透析FCS和丙…
Discussion
HPLC分离的活细胞聚糖的脉冲追逐分析提供了一个学习生活的一种糖蛋白，低聚糖的结构上的改动动态方法。有越来越多的证据表明，这样的改变是在参与生产的信号ER折叠，质量控制和贩运系统 2-5 。不仅对一个特定的糖蛋白的利益，但也总糖蛋白，如本文所示，我们比较一个特定的ERAD基板对比的命运和细胞糖蛋白池的结构动力学分析，该方法可应用于。净化技术是简单但却十分具体。?…
Acknowledgements
我们感谢Zehavit Frenkel和桑德拉Tolchinsky技术援助。有关这项工作的研究是由以色列科学基金会（1229年至1207年），德国和以色列的项目合作（DIP – DFG）的赠款支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Referencias
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
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Pulse-chase AnalysisN-linked Sugar ChainsGlycoproteinsMammalian CellsGlc3Man9GlcNAc2 Precursor OligosaccharideER ModificationSecretory ProteinsGlycoprotein Quality ControlTrafficking SignalsProteomic AnalysisDynamics Of Sugar Chain ProcessingLabeling And Pulse-chase Analysis ProtocolsMetabolically Labeled N-linked Oligosaccharides[2-3H] Mannose LabelingDenaturing LysisEnzymatic ReleaseImmunoprecipitated ProteinGeneral Glycoprotein PoolEndo H TreatmentN-glycosidase F TreatmentMolecular FiltrationHPLC Analysis
Citar este artículo
Avezov, E., Ron, E., Izenshtein, Y., Adan, Y., Lederkremer, G. Z. Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (38), e1899, doi:10.3791/1899 (2010).