Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.
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Artículo de método
Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero
En este artículo
Resumen
Resumen
La unión de la Glc
Protocolo
El protocolo está destinada para el análisis de cadenas de azúcares de las glicoproteínas o total de una glicoproteína de interés específico. El procedimiento es básicamente el mismo en ambos casos con algunas modificaciones como se indica a través del protocolo.
- Para el etiquetado del metabolismo de N-glicanos ligados uno tiene que usar una cultura subconfluentes de células de mamífero cultivadas durante la noche en una placa de 90 mm para cada muestra (muestras pueden representar diferentes puntos de tiempo o de tratamientos). Este protocolo está optimizado para las células NIH 3T3.
- Comer a las células de la glucosa por la incubación en 5 ml ....
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Discusión
El análisis del pulso-caza de los glicanos en las células vivas con una separación de HPLC proporciona un método para el estudio de la dinámica de los oligosacáridos alteraciones estructurales a lo largo de la vida de una glicoproteína. Hay una creciente evidencia de que tales alteraciones están involucrados en la producción de las señales para doblar ER, control de calidad y sistemas de tráfico 2-5. El método se puede aplicar no sólo para una glicoproteína de interés específico, sino también para analizar la.......
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Agradecimientos
Damos las gracias a Zehavit Frenkel y Tolchinsky Sandra de asistencia técnica. La investigación relacionada con este trabajo es apoyado por becas de la Fundación Ciencia Israel (1229-1207) y el alemán-israelí Proyecto de Cooperación (DIP-DFG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Controlador del sistema multisolvente 600E | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrilo LiChrosolv (grado gradiente para cromatografía líquida) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K o Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 o 4208 | |
| Concentrador 5301, incl. rotor de ángulo fijo para 48 x 1,5 / 2,0 ml | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| F dializado–suero de ternera | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Águila modificada’s Medio | GIBCO, por Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modificado de Eagle’s Medio - sin glucosa | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| sal disódica de EDTA (Titriplex III) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Kit Endo Hf (1.000.000 unidades/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–suero de feto bovino (FBS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| colector de fracciones Frac-100 | Amersham | 18-1000-77 | |
| Sistemas de conteo por centelleo líquido LS 6500 | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Manosa, D-[2-3H(N)]- (Actividad específica: 15-30 Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoil-leucil-leucil-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glicosidasa F (1000 unidades/ml) | Grupo Roche | 11365177 | |
| N-octilglucósido | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| Células NIH 3T3 | Colección Americana de Cultivos Tipo | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Solución de ácido fosfórico (49-51 %, para HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasas | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Perlas de Sepharosa con proteína A | Repligen | IPA300 | |
| Anticuerpo policlonal de conejo anti-H2 carboxi-terminal 6 | |||
| Deoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Dodecilsulfato de sodio | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Fosfato de sodio | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Solución de piruvato de sodio (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Columna Spherisorb NH2, 5 μm, 4,6 x 250 mm | Aguas | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Procesadores ultrasónicos Vibra-Cell VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Tampón A: 1% Triton X-100, 0,5% p/v desoxicolato sódico, inhibidor de proteasas en cóctel al 2% v/v en PBS | |||
| Tampón B: 0,5% p/v SDS, cóctel de inhibidores de proteasas al 2% v/v en PBS | |||
| Tampón C: Tampón de reacción de N-glicosidasa F: 200 mM Na3PO4, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5 % N-octilglucósido | |||
| NIH 3T3 que expresan establemente H2a 6 | |||
| Tampón D: 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v desoxicolato sódico, 0,5% p/v SDS, inhibidor de proteasas en cóctel al 2% v/v en PBS | |||
| Tampón E: 0,5% p/v SDS, 1% v/v 2-mercaptoetanol–etanol, coctel de inhibidores de proteasas al 2 % v/v en PBS | |||
| 2-mercaptoetanol–etanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Referencias
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z.
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Reimpresiones y permisos
