Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Summary

Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.

Abstract

Fixação do Glc₃ Homem₉ GlcNAc₂ Precursor oligossacarídeo de polipeptídeos nascentes na ER é uma modificação comum para proteínas secretoras. Embora esta modificação foi implicado em vários processos biológicos, os aspectos adicionais de sua função estão surgindo, com a evidência recente de seu papel na produção de sinais para o controle de qualidade e glicoproteína tráfico. Assim, os fenômenos relacionados com a N-glicanos ligados e seu processamento estão sendo intensamente investigadas. Métodos que têm sido recentemente desenvolvidos para a análise proteômica têm melhorado bastante a caracterização da glicoproteína N-glicanos ligados. No entanto, eles não fornecem insights sobre a dinâmica da cadeia de processamento de açúcar envolvidos. Para isso, rotulagem e protocolos de pulso-chase análise são usados ​​que normalmente são complexos e dão rendimentos muito baixos. Descrevemos aqui um método simples para o isolamento e análise de metabolicamente marcados N-linked oligossacarídeos. O protocolo baseia-se na marcação das células com [2 -³ H] lise, desnaturação manose e liberação enzimática do oligossacarídeos a partir de qualquer uma proteína específica immunoprecipitated de interesse ou da piscina glicoproteína geral por meio de tratamentos seqüenciais com endo H e N-glicosidase F, seguido de filtração molecular (Amicon). Neste método, os oligossacarídeos isolados servir como insumo para HPLC análise, que permite a discriminação entre as várias estruturas glicano acordo com o número de unidades de monossacarídeo composto por eles, com uma resolução de um monossacarídeo único. Usando este método conseguimos estudar alta manose N-linked perfis de oligossacarídeos de glicoproteínas total de células após o pulso-chase em condições normais e sob inibição do proteassoma. Esses perfis foram comparados com aqueles obtidos a partir de uma ER associada à degradação do substrato immunoprecipitated (ERAD). Nossos resultados sugerem que a maioria dos NIH 3T3 glicoproteínas celulares são relativamente estáveis ​​e que a maioria de seus oligossacarídeos são aparados para Homem_08/09 GlcNAc₂. Em contraste, substratos ERAD instáveis ​​são aparados para Homem_05/06 GlcNAc₂ E glicoproteínas tendo estas espécies se acumulam sobre a inibição da degradação proteosomal.

Protocol

O seguinte protocolo destina-se a análise de cadeias de açúcar de glicoproteínas total ou de uma glicoproteína específica de interesse. O procedimento é basicamente o mesmo para ambos os casos, com algumas alterações como indicado ao longo do protocolo. Para a rotulagem metabólica de N-glicanos ligados a pessoa precisa usar uma cultura confluentes de células de mamíferos cultivadas durante a noite em um prato de 90 mm para cada amostra (amostras podem representar diferentes momentos ou tratament…

Discussion

A análise do pulso-chase dos glicanos em células vivas, com separação por HPLC fornece um método para estudar a dinâmica do oligossacarídeo alterações estruturais ao longo da vida de uma glicoproteína. Há evidências crescentes de que tais alterações estão envolvidos na produção dos sinais de ER dobrar, controle de qualidade e ^2-5 sistemas tráfico. O método pode ser aplicado não só para uma glicoproteína específica de interesse, mas também para analisar a dinâmica da estrutura de glico…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
600E Multisolvent delivery System controller		Waters	WAT062710
Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)		Merck Bioscience	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30		Millipore	UFC503024 or 4208
Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor		Eppendorf	5301 000.016
Dialyzed Foetal Calf Serum		Biological Industries	04-011-1A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium		Gibco Invitrogen Cell Culture	41965039
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free		Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)		Sigma-Aldrich	D1408
EDTA disodium salt (Titriplex Iii)		Merck	1084180250
Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)		New England Biolabs	p0703S
Foetal Calf Serum (FCS)		Biological Industries	04-001-1A
Frac-100 fraction collector		Amersham Biosciences	18-1000-77
LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems		Beckman Coulter	510720
Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)		PerkinElmer Life Sciences	NET570A
N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)		Calbiochem	474790
N-glycosidase F (1000 units/ml)		Roche	11365177
N-octylglucoside		Sigma-Aldrich	O3757
NIH 3T3 cells		American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1658
Opti-Flour		PerkinElmer Life Sciences	6013199
Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)		Fluka	79607
Protease Inhibitor Cocktail		Sigma-Aldrich	P2714
Protein A-Sepharose beads		Repligen	IPA300
Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6
Sodium deoxycholate		Sigma-Aldrich	30970
Sodium dodecyl sulfate		Bio-RAD	161-0301
Sodium phosphate		Sigma-Aldrich	342483
Sodium pyruvate solution (100mM)		Sigma-Aldrich	S8636
Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm		Waters	PSS831115
Triton X-100		BDH	306324N
Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750		Sonics and Materials, Inc.	690-003
Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside
NIH 3T3 stably expressing H2a 6
Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
2-mercaptoethanol		Sigma-Aldrich	M3148