Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.
Abstract
Emerald kül delici (EAB,<em> Agrilus planipennis</em>), Dişbudak ağaçları, milyonlarca öldürdü egzotik bir invaziv haşere, (<em> Fraxinus</em> Spp.) Kuzey Amerika.<strong></strong> EAB hızla yayılmaya devam ediyor ve saldırılar olgun ağaçların fidan, farklı yaşlardaki ağaçların dişbudak. Ancak, çok az bir tarih ya da herhangi bir moleküler bilgi EAB var. Biz doku düzeyinde moleküler tabanlı fizyolojik süreçleri deşifre ilgilenen dişbudak ağaçları başarılı kolonizasyon yardım EAB. Bu yazıda tespit mRNA düzeyleri farklı larva dokular (midgut, yağ organları ve manikür de dahil olmak üzere) ve farklı gelişim evreleri (1 de dahil olmak üzere etkin kullanımı kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR)<sup> St</sup> – 2<sup> Nd</sup> – 3<sup> Rd</sup> – 4<sup> Th</supEAB> instars, prepupae ve yetişkinler). Bir örnek olarak, bir peritrophin geni (burada adında,<em> AP-PERI1</em>), Ilgi gen ve ribozomal protein (örneğinde<em> AP-RP1</em>), Iç kontrol olarak. Peritrophins böcek bağırsak astar peritrophic membran / matris (PM), önemli bileşenleridir. PM midgut epitel sindirim ve mekanik koruma da dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonları vardır.
Protocol
Farklı adımlar ile tam protokolü akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Diseksiyonu oluşturan bireysel adımlar, RNA ekstraksiyon, İlk Strand cDNA sentezi ve QRT-PCR aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. I. Larvaların Diseksiyon Bu prosedürün başlaması, yer Emerald kül delici veya EAB, nemli kağıt mendil larvaları önce diseksiyonu kadar. Taze hazırlanan 1X fosfat diseksiyonu boyunca tampon soğuk tutmak için buz üzerinde, ya da PBS, tampon…
Discussion
Eşik döngüleri (Ct) değeri, QRT-PCR plaka her bir numune için elde edilir. Standart eğri yapmak için, her bir dilüsyon için elde Ct değeri, onun konsantrasyonu günlük karşı çizildi. Deney numuneleri için Ct değerlerini daha sonra bu seyreltme serisi standart eğrisi üzerine çizilen. Hedef miktarları, her deney yani doku ve gelişim ifade için ayrı bir standart eğrileri hesaplandı. Göreceli ifade değerleri (devir), daha sonra iç kontrol için elde edilen miktar (AP-RP1) ile ilgi hedef …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz deneylerin kurulum, Lourdes Delta Arrueta Antequera (Entomoloji Bölümü, Ohio State Üniversitesi / OARDC, Wooster, OH) tarafından sağlanan yardım kabul etmiş sayılırsınız. Dr Therese Polonya (USDA, Orman Hizmetleri, NRS) EAB larva örnekleri göndermek için teşekkür ederim. Yardım mikroskop kurulum takdir Dr. Luis Canas ve Nuriş M Acosta tarafından sağlanan. Ohio Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Merkezi, Ohio State Üniversitesi tahsis Eyalet ve Federal fonları tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.
Bhandary, B., Rajarapu, S. P., Rivera-Vega, L., Mittapalli, O. Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR. J. Vis. Exp. (39), e1974, doi:10.3791/1974 (2010).