Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות
Summary
כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.
Abstract
עכבישים מודרנית ספין ביצועים גבוהים סיבי משי עם מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ללכוד, טרף תנועה והגנה על פיתוח 1,2 צאצאים. עכבישים לבצע משימות אלה על ידי ספינינג כמה סוגי סיבים שונים שיש להם תכונות מכניות שונות. התמחות כזו של סוגי סיבים אירעה דרך באבולוציה של משי בלוטות ייצור שונות, אשר לתפקד biofactories קטן. אלה מייצרים biofactories ולאחסן כמויות גדולות של חלבונים משי לייצור סיבים. באמצעות סדרה מורכבת של אירועים ביוכימיים, חלבונים אלה משי מומרים מנוזל לחומר מוצק על שחול.
מחקרים הוכיחו כי מכונות משי עכביש חזקים יותר מפלדה גבוהה מתיחה 3. ניתוח להבין את הקשר בין המבנה והתפקוד של הנושאים עכביש המשי חשפו כי קורי עכביש מורכב בעיקרו של חלבונים, או fibroins, כי יש לחסום חוזר בתוך רצפי חלבונים שלהם 4. חתימות מולקולרית נפוצים התורמים לחוזק מתיחה מדהימה הרחבה של משי עכביש נמצאים פרומים דרך ניתוח cDNAs משי המתורגם. בהינתן מאפייני החומר יוצא דופן של עכביש המשי, מעבדות מחקר ברחבי העולם מתחרים להבין לחקות את תהליך ספינינג לייצר סיבי משי סינתטי עבור יישומים מסחריים, צבאיים ותעשייתיים. אחד האתגרים העיקריים ספינינג קורי עכביש מלאכותיים במעבדה מחקר כרוך הבנה מלאה של התהליכים הביוכימיים המתרחשים במהלך שחול של סיבי המשי לייצור בלוטות.
כאן אנו מציגים שיטה הבידוד של שבע משי לייצור שונים מן הבלוטות cobweaving עכביש האלמנה השחורה, הכוללת את בלוטות ampullate ראשיות ומשניות [מייצרת גרר ופיגומים משי] 5,6, tubuliform [במקרה מסנתז משי ביצה] 7 , 8, flagelliform [פונקציה ידוע קלח-אורגים], במצטבר [עושה משי דבק], aciniform [מסנתז גלישת טרף במקרה האשכולות ביצה] 9 ו pyriform [מייצרת משי מצורף דיסק] 10. גישה זו מבוססת על הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן, ההפרדה הבאות של cephalothorax מן הבטן, והוא microdissection של הבטן כדי להשיג את משי לייצור בלוטות. בעקבות ההפרדה של משי לייצור בלוטות שונות, רקמות אלה ניתן להשתמש כדי לאחזר מקרומולקולות ביוכימיים שונים עבור ניתוחים שונים, כולל כמותי בזמן אמת PCR, הצפוני והמערבי סופג, ספקטרומטריית מסה (MS או MS / MS) מנתח לזהות חדש רצפי חלבון משי, לחפש חלבונים להשתתף במסלול הרכבה משי, או להשתמש רקמות שלמות על תרבית תאים או ניסויים היסטולוגית.
Protocol
Discussion
המתודולוגיה שלנו microdissection של משי לייצור בלוטות מן עכביש האלמנה השחורה מציעה אמצעי יעיל להשגת מטוהרים לייצור משי בלוטות. והניתוחים ניתן להשלים 1.5-3 שעות, מניב סט שלם של שבע נפרדות לייצור משי בלוטות מ cobweavers. קבלת מטוהרים משי בלוטת דגימות מאפשרת לחוקרים את היכולת לבצע מג?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אפיון רוי NSF MCB-0950372 גרנט מולקולרית זכאי של משי עכביש האלמנה השחורה.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referencias
- Vollrath, F., Knight, D. P. . Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. . J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. . Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. . Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. . Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. . Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. . Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. . Bioquímica. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. . J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. . Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. . J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
