Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono
Summary
Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.
Abstract
Ragni moderni rotazione ad alte prestazioni fibre di seta con una vasta gamma di funzioni biologiche, compresa la cattura delle prede locomozione, lo sviluppo e la protezione di 1,2 figli. Ragni eseguire queste operazioni da diversi tipi di filatura di fibre distinte che hanno diverse proprietà meccaniche. Specializzazione di tale tipi di fibre si è verificato attraverso l'evoluzione delle diverse ghiandole che producono la seta, che funzionano come biofabbriche di piccole dimensioni. Queste produzione biofabbriche e archiviare grandi quantità di proteine della seta alla produzione di fibre. Attraverso una complessa serie di eventi biochimici, queste proteine della seta vengono convertite da un liquido in un materiale solido su di estrusione.
Gli studi hanno dimostrato che la meccanica seta di ragno sono più forti di acciaio ad alta resistenza 3. Le analisi per comprendere la relazione tra la struttura e la funzione di fili di seta di ragno hanno rivelato che la seta di ragno è costituito in gran parte delle proteine, o fibroins, che hanno ripete blocco all'interno del loro sequenze di proteine 4. Comune firme molecolari che contribuiscono alla resistenza alla trazione incredibile e l'estensibilità di seta di ragno vengono svelati attraverso l'analisi di cDNA seta tradotte. Date le straordinarie proprietà del materiale di ragno sete, laboratori di ricerca in tutto il mondo fanno a gara per capire e simulare il processo di filatura per la produzione di fibre di seta sintetica per applicazioni commerciali, industriali e militari. Una delle sfide principali di filatura della seta artificiale ragno in laboratorio di ricerca comporta una completa comprensione dei processi biochimici che si verificano durante l'estrusione di fibre della seta ghiandole che producono.
Qui vi presentiamo un metodo per l'isolamento di sette diverse ghiandole che producono la seta dal ragno cobweaving vedova nera, che include le ghiandole ampullate maggiori e minori [produce seta dragline e ponteggi] 5,6, tubuliform [seta uovo sintetizza caso] 7 , 8, flagelliform [funzione sconosciuta in pannocchia-tessitori], aggregato [rende seta colla], aciniforme [preda sintetizza il confezionamento e le discussioni caso uovo] 9 e piriforme [attaccamento produce seta disco] 10. Questo approccio si basa su anestetizzare il ragno con il gas di anidride carbonica, successiva separazione del cefalotorace con l'addome, e microdissezione del ventre per ottenere le ghiandole che producono la seta. Dopo la separazione dei diversi seta ghiandole che producono, questi tessuti possono essere utilizzati per recuperare le macromolecole diverse per distinte analisi biochimiche, tra cui quantitativa real-time PCR, nel nord-ovest e assorbente, la spettrometria di massa (MS o MS / MS), analisi per identificare nuove sequenze di proteine della seta, ricerca per le proteine che partecipano al percorso di assemblaggio di seta, o utilizzare il tessuto intatto per colture cellulari o esperimenti istologici.
Protocol
Discussion
La nostra metodologia per la microdissezione della seta ghiandole che producono dalla vedova nera offre un mezzo efficace per ottenere altamente purificato seta ghiandole che producono. Dissezioni può essere completato in 1,5 a 3 ore, producendo un set completo di sette distinte seta ghiandole che producono da cobweavers. Ottenere altamente purificato seta ghiandola campioni consente agli investigatori la possibilità di eseguire una vasta gamma di studi biochimici, inclusa l'identificazione di seta o di nuove prot…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una RUI NSF Concessione MCB-0950372 dal titolo Caratterizzazione molecolare di Sete Ragno Nero Widow.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referencias
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