Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de
Summary
Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.
Abstract
Aranhas modernas produzir fibras de alta performance de seda com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção captura de presas e de proteção de desenvolver 1,2 filhos. Aranhas realizar essas tarefas, girando várias tipos de fibras distintas, que têm diferentes propriedades mecânicas. Tal especialização de tipos de fibras ocorreu através da evolução de diferentes glândulas produtoras de seda, que funcionam como biofábricas de pequeno porte. Estes fabricação biofábricas e armazenar grandes quantidades de proteínas da seda para a produção de fibra. Através de uma série complexa de eventos bioquímicos, essas proteínas da seda são convertidos de um líquido em um material sólido em cima de extrusão.
Estudos têm demonstrado que a mecânica sedas de aranha são mais fortes que aço de alta resistência 3. Análises para entender a relação entre a estrutura ea função dos fios de seda de aranha têm revelado que a seda da aranha é constituída principalmente de proteínas, ou fibroins, que repete bloco dentro suas seqüências de proteínas 4. Comum assinaturas moleculares que contribuem para a resistência à tração incrível e extensibilidade de sedas de aranha estão sendo desvendados através da análise de cDNAs de seda traduzido. Dadas as propriedades do material extraordinário de aranha sedas, laboratórios de pesquisa em todo o mundo estão correndo para compreender e imitar o processo de fiação para produzir fibras de seda sintética para aplicações comerciais, militares e industriais. Um dos principais desafios a fiação de seda de aranha artificial em laboratório de pesquisa envolve um completo entendimento dos processos bioquímicos que ocorrem durante a extrusão das fibras das glândulas produtoras de seda.
Aqui apresentamos um método para o isolamento de sete de produção de seda diferentes glândulas da aranha viúva-negra cobweaving, que inclui as glândulas ampullate maiores e menores [fabrica dragline e andaimes de seda] 5,6, tubuliform [sintetiza seda caso do ovo] 7 , 8, flagelliform [função desconhecida em cob-tecelões], agregada [faz seda cola], aciniform [embrulho presa sintetiza e tópicos caso do ovo] 9 e piriforme [produz apego seda disco] 10. Esta abordagem baseia-se anestesiar a aranha com gás de dióxido de carbono, a separação posterior do cefalotórax do abdômen, e microdissecção do abdômen para obter as glândulas produtoras de seda. Após a separação dos diferentes glândulas produtoras de seda, estes tecidos podem ser usados para recuperar macromoléculas diferentes para distintas análises bioquímicas, incluindo quantitativos PCR em tempo real, no norte e oeste blotting, espectrometria de massa (MS ou MS / MS) analisa a identificar seqüências de seda novas proteínas, pesquisa de proteínas que participam na via montagem de seda, ou usar o tecido para cultura de células intactas ou experiências histológica.
Protocol
Discussion
Nossa metodologia para a microdissecção das glândulas produtoras de seda da aranha viúva-negra oferece um meio eficaz para obter altamente purificada de seda glândulas produtoras. Dissecções podem ser concluídas em 1,5 a 3 horas, resultando em um conjunto completo de sete distintas seda glândulas produtoras de cobweavers. Obtenção altamente purificada de seda glândula-amostras permite os investigadores a capacidade de executar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação de seda novo o…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma doação RUI NSF MCB-0950372 Caracterização Molecular de direito Silks aranha viúva negra.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referencias
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