الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة التنفس من الميتوكوندريا المعزولة من عضلات الهيكل العظمي. وقد تم تكييف هذا الأسلوب من Scorrano<em> وآخرون.</em> (2007). لإجراء العزل الميتوكوندريا يتطلب حوالي 2 ساعة. ويمكن الانتهاء من تنفس الميتوكوندريا في حوالي 1 ساعة.
Abstract
الميتوكوندريا هي عضيات السيطرة على حياة وموت الخلية. يشاركون في التفاعلات الأيضية الرئيسية ، تجميع معظم لاعبي التنس المحترفين ، وتنظيم عدد من الإشارات شلالات 2،3. وقد عزل الباحثون في الماضي والحاضر الميتوكوندريا من أنسجة الجرذان والفئران مثل المخ والكبد والقلب 4،5. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من الباحثين على دراسة وظيفة الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي.
هنا ، نحن تصف الطريقة التي استخدمناها بنجاح لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي 6. إجراءاتنا يتطلب أن يتم إجراء كافة المخازن والكواشف الطازجة ويحتاجون لحوالي 250-500 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات. درسنا الميتوكوندريا المعزولة من الساق الجرذان والفئران والحجاب الحاجز والعضلات خارج المقلة الفئران. ويتم قياس تركيز البروتين الميتوكوندريا مقايسة مع برادفورد. من المهم أن تظل عينات الجليد الميتوكوندريا الباردة خلال إعداد وتنفيذ الدراسات أن وظيفية في غضون فترة زمنية قصيرة نسبيا (~ 1 ساعة). ويتم قياس التنفس الميتوكوندريا باستخدام تخطيط الاستقطاب الكهربائي مع كلارك من نوع (Oxygraph النظام) عند 37 درجة مئوية 7. معايرة القطب الأكسجين هو خطوة أساسية في هذا البروتوكول ، ويجب أن يقوم عليها يوميا. الميتوكوندريا المعزولة (150 ميكروغرام) تضاف إلى 0.5 مل من العازلة التجريبية (EB). 2 حالة التنفس يبدأ مع اضافة الغلوتامات (5mM) ومالات (2.5 ملم). ثم ، يضاف ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (150 ميكرومتر) لبدء ولاية 3. يستخدم Oligomycin (1 ميكرون) ، ومانع سينسيز أتباز ، لتقدير الدولة 4. أخيرا ، الكربونيل السيانيد ف [trifluoromethoxy] هو المضافة فينيل هيدرازون (FCCP ، و 0.2 ميكرومتر) لmeasurestate 5 أو 6 uncoupled التنفس. ويتم احتساب نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) ، ونسبة 3 إلى حالة الدولة 4 ، بعد كل تجربة. يعتبر RCR ≥ 4 كدليل على مستحضر الميتوكوندريا قابلة للحياة.
باختصار ، نقدم طريقة لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي التي يمكن استخدامها في (مثل نشاط انزيم ، مناعي ، البروتيوميات ،) البيوكيميائية والدراسات الفنية (الميتوكوندريا التنفس).
Protocol
Discussion
نقدم بروتوكول لعزل الميتوكوندريا قابلة للحياة من عضلات الهيكل العظمي. إذا كان العائد هو المشكلة ، يمكن تعديل البروتوكول من قبل تفرخ في عضلة معزولة في 5 مل من PBS/10mM التربسين EDTA/0.01 ٪ لمدة 30 دقيقة في الجليد. لضمان إتمام عملية الهضم العضلات مع التربسين ، والعضلات تحتاج إلى …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY12998) لاندرادي FH.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referencias
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
