골격근에서 Mitochondrial 절연
Summary
이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다<em> 외.</em> (2007). mitochondrial 절연 절차는 약 2 시간이 필요합니다. mitochondrial 호흡은 약 1 시간에 완료할 수 있습니다.
Abstract
Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다.
여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P – [trifluoromethoxy]이 – 페닐 – hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.
요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.
Protocol
Discussion
우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referencias
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
