Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano Et al. (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos que controlan la vida y la muerte de la célula. Participan en las principales reacciones metabólicas, síntesis de la mayor parte de la ATP, y regular una serie de cascadas de señalización ^2,3. Los investigadores del pasado y actuales tienen mitocondrias aisladas de tejidos de ratas y ratones, como el hígado, cerebro y corazón ^4,5. En los últimos años, muchos investigadores se han centrado en estudiar la función mitocondrial de los músculos esqueléticos.

Aquí se describe un método que hemos utilizado con éxito para el aislamiento de las mitocondrias de los músculos del esqueleto ^6. Nuestro procedimiento requiere que todos los tampones y reactivos son frescas y la necesidad de 250-500 mg de músculo esquelético. Hemos estudiado las mitocondrias aisladas de gastrocnemio de ratas y ratones y el diafragma y los músculos extraoculares rata. Concentración de proteína mitocondrial se mide con el ensayo de Bradford. Es importante que las muestras se mantendrán mitocondrial helado durante la preparación y que los estudios funcionales se realizará en un plazo relativamente corto (aproximadamente 1 hora). Respiración mitocondrial se mide utilizando la polarografía con un electrodo tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C ^7. La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse diariamente. Mitocondrias aisladas (150 mg) se añadió a 0,5 ml de solución tampón experimental (EB). Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato (5 mm) y malato (2,5 mM). Entonces, la adenosina difosfato (ADP) (150 M) se añade al estado de inicio 3. Oligomicina (1 M), un bloqueador de la sintasa de ATP-asa, se utiliza para estimar el estado 4. Por último, el cianuro carbonilo p-[trifluorometoxi]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 M) se añade a measurestate 5, o no enganchados respiración ^6. La relación del control respiratorio (RCR), la relación entre el estado 3 al estado 4, se calcula después de cada experimento. Un RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable.

En resumen, se presenta un método para el aislamiento de las mitocondrias viable de los músculos esqueléticos que pueden ser utilizados en estudios bioquímicos (por ejemplo, la actividad enzimática, inmunodetección, proteómica) y funcionales (respiración mitocondrial).

Protocolo

1. Preparación de tampones

1. Encienda 5804R centrífuga y se puso a 4 ° C. A su vez en baño de agua Isotemp 3006D y se puso a 37 º C.
2. Prepare las siguientes soluciones antes de que el aislamiento del músculo:
   • PBS: Disolver tampón fosfato salino (PBS) tabletas en agua destilada (5 comprimidos / litro). Mezclar bien.
   • PBS más 10 mM EDTA: Para preparar una solución de 100 ml, añadir 2 ml de 500 mM EDTA y 98 ml de PBS.
   • Buffer 8X mitocondrias: 10,28 g de sacarosa, para una concentración final de 0,6 M, 400 mg de ácidos grasos libres de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para una ....

Discusión

Se presenta un protocolo para aislar viable mitocondrias de los músculos esqueléticos. Si el rendimiento es un problema, el protocolo puede ser modificado mediante la incubación de los músculos aislados en 5 ml de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% durante 30 minutos en hielo. Para asegurar la digestión completa del músculo con tripsina, el músculo tiene que ser totalmente picada. Después de la incubación de 30 minutos, la solución PBS/10mM EDTA/0.01% de tripsina debe ser reemplazado por completo con 3 ml de tampón de aislami.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de 95 % CO2 / 5 % O2	Proveedor local de gases
Sal sódica del adenosín 5′-difosfato	Sigma-Aldrich	A2754
Papel Blue Rizla	Hansatech	890101
Ensayo de proteínas de Bradford	Bio-Rad	500-0006
Carbonylcianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Centrífuga 5804R	Eppendorf
Nitrógeno comprimido	Proveedor local de gases
D-manitol	Sigma-Aldrich	M9647
Ácido etilenglicol-bis-tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Ácido graso libre de albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A8806
Ácido glutámico	Sigma-Aldrich	G5889
Sal sódica de HEPES	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Ratas macho Sprague Dawley	Harlan Laboratories	300-500 g
Ácido málico	Sigma-Aldrich	M9138
Minifuge	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomicina	Sigma-Aldrich	O4876
Disco del electrodo de oxígeno	Hansatech	S1
Oxigrafo	Hansatech
Software Oxygraph Plus V1.01	Hansatech
Medidor de pH	Mettler Toledo	1225506149
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P8416
Homogeneizadores Potter-Elvehjem	Fisher Scientific	08-414-14A
Membrana de PTFE (0,0125 mm × 25 mm)	Hansatech	S4
Broca SKIL 3320	Tienda de ferretería
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S5016