骨骼肌的线粒体分离
Summary
这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano<em>等。</em>（2007年）。线粒体的分离过程中需要约2小时。线粒体呼吸在大约1个小时就可以完成。
Abstract
线粒体是细胞器控制细胞死亡的生命和。他们参与重要的代谢反应，合成的ATP，规范的信号级联 2,3 。过去和目前研究人员已经从大鼠和小鼠的组织，如肝，脑和心脏4,5中分离出线粒体。近年来，许多研究人员都集中在研究从骨骼肌线粒体功能。
在这里，我们描述了，我们已经成功地用于从 6骨骼肌线粒体隔离的方法。我们的程序要求，所有的缓冲液和试剂都取得了新的和需要约250-500毫克骨骼肌。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌和隔膜中分离出线粒体，鼠眼外肌。线粒体蛋白浓度测定Bradford法。重要的是保持在编制和功能的研究是一个相对较短的时间（约1小时）内进行线粒体样品冰冷。线粒体呼吸是用一个克拉克型电极（Oxygraph系统）在37 ° C 7极谱。氧电极的校准是在本议定书中的关键一步，它每天必须执行。隔离线粒体（150微克）被添加到实验缓冲液（EB）0.5毫升。国家2呼吸开始，除谷氨酸（5MM）和苹果酸（2.5毫米）。然后，二磷酸腺苷（ADP）（150微米）被添加到启动状态3。寡（1μM），ATP酶合成酶阻断剂，用于估计状态4。最后，羰基氰化物的P -三氟甲氧基] -苯基腙（FCCP，0.2微米）添加到measurestate 5，或耦合呼吸 6 。呼吸控制率（RCR），状态3状态4的比例，计算后，每一个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。
总之，我们目前的隔离，可用于生化（例如，研究酶的活性，免疫检测，蛋白质组学）和功能（线粒体呼吸）的骨骼肌线粒体可行的方法。
Protocol
Discussion
我们提出了一个协议孤立可行的骨骼肌线粒体。如果收益率是一个问题，该协议可以修改孵化5毫升30分钟，在冰PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶的孤立肌肉。为了保证胰蛋白酶完成肌肉消化，肌肉需要充分剁碎。 PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶溶液孵育30分钟后，必须完全取代隔离缓冲区1（IB1）3毫升。此外，使用胰蛋白酶，可能会干扰线粒体呼吸协议中的一些基板。这一协议处于良好的使用胰蛋白酶时线粒?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由一个由美国国家眼科研究所（R01 EY12998）授予FH安德拉德支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referencias
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
