赖氨酸去甲基化酶活性的定量测量中的应用的MassSQUIRM
Summary
我们提出了一个使用MALDI质谱和还原甲基化化学的方法来量化赖氨酸甲基化的变化。
Abstract
近日，后生监管机构已发现1-3在许多不同的疾病的关键球员。因此，这些酶的主要目标是为小分子的研究和药物开发4。许多后生监管机构最近才发现，仍然是在被分类的过程。在这些酶的赖氨酸去甲基从组蛋白和其他蛋白质的赖氨酸甲基组。由于这一类酶的小说性质，一些实验已经开发，研究他们的活动。这一直是一个路障，以分类和高吞吐量研究组蛋白去甲基化酶。目前，很少去甲基化酶检测存在。那些确实存在往往在本质上是定性的，不能同时不同赖氨酸甲基化状态之间的辨别（联合国，单，二和三）。质谱是常用来确定脱甲基酶活性，但目前质谱分析没有解决差异甲基化多肽是否不同的电离。差甲基化肽的电离，使甲基化状态比较困难，肯定不定量（图1A）。因此，可以检测不优化为脱甲基酶活性的全面分析。
在这里，我们描述的方法称为MassSQUIRM（质谱定量使用同位素还原甲基）是基于还原甲基氘甲醛强制所有赖氨酸是DI-甲基胺基，从而使它们基本上是相同的化学物质，因此，电离相同（图1B）。唯一的化学还原甲基化的差异，是氢和氘，这并不影响电离电离效率。 MassSQUIRM法是与联合国，单或二甲基赖氨酸去甲基反应产物具体。该法也适用于赖氨酸甲基转移给SA我的反应产物。在这里，我们使用相结合的还原甲基化化学和MALDI质谱测量类LSD1活动，赖氨酸去甲基化酶能够消除DI-和单甲基基团，合成肽基板5。此法是简单，容易服从任何与电离质谱在实验室或通过蛋白质组学设施的实验室。该法〜8倍的动态范围，很容易扩展到板格式5。
Protocol
Discussion
MassSQUIRM是一种廉价单和二甲基赖氨酸去甲基化酶活性的综合分析和定量的方法。 MassSQUIRM提供定量不仅对产品的反应，但也为中间体。此法可以用来作为一个强大的工具学习类LSD1和其他组蛋白去甲基化酶的机制。这也将是有益的许多新发现PHF8如赖氨酸去甲基酶的分类，可用于某些甲基酶。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢质谱支持UAMS蛋白质组学设施。由NIH资助P20RR015569，P20RR016460和R01DA025755为这个项目提供了资金。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Referencias
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