リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション
Summary
我々は、リジンメチル化の変化を定量化するためにMALDI質量分析法と還元的メチル化化学を使用するための手法を提案する。
Abstract
最近では、エピジェネティックな調節因子は1-3さまざまな疾患の主要なプレーヤーとして発見されました。その結果、これらの酵素は、小分子の研究や薬剤開発4の主要な標的である。多くのエピジェネティックなレギュレータは、ごく最近発見されていると分類されているプロセスにまだある。これらの酵素の中ではヒストンや他のタンパク質のリジンからメチル基を除去するリジン脱メチル化酵素である。酵素のこのクラスの新たな性質のために、いくつかのアッセイは、彼らの活動を研究するために開発されている。これは、分類とヒストン脱メチル化酵素のハイスループット研究の両方に道路ブロックされています。現在、非常に少数のデメチラーゼアッセイは存在しています。存在することをそれらは自然の中で定性的な傾向にあると同時に、異なるリジンメチル化の状態（非、モノ – 、ジ – およびトリ – ）の間に識別することはできません。質量分析は、一般的に脱メチル化酵素活性を測定するために使用されるが、現在の質量分析アッセイはないということです差動メチル化ペプチドが異なってイオン化するかどうかに対処できません。メチル化ペプチドの差イオンは、メチル化状態は難しい（図1A）確かに定量的ではないと比較になります。したがって、利用可能なアッセイは、脱メチル化酵素活性の包括的な分析のために最適化されていません。
ここでは、このように本質的に同じ化学種、それらを作るため、イオン化し、すべてのリジンジ – メチル化を強制的に重水素化されたホルムアルデヒドとアミン基の還元的メチル化に基づいていますMassSQUIRMと呼ばれる方法（同位体の還元的メチル化を用いた質量分析の定量）を記述（図1B）と同じです。還元的メチル化後にのみ化学の違いは、MALDIイオン化効率に影響を与えません水素と重水素である。 MassSQUIRMアッセイは非、モノ – 又はジ – メチルリジンの脱メチル化反応生成物に対して特異的である。アッセイはまた、saを与えリジンメチルトランスフェラーゼにも適用可能である私の反応生成物。ここでは、還元的メチル化化学とLSD1の活性を測定するためのMALDI質量分析、合成ペプチドを基板5上に、ジ-およびモノメチル基を除去することができるリジン脱メチル化酵素の組み合わせを使用します。このアッセイは、ラボやプロテオミクス機能を通じてMALDI質量分析計へのアクセス権を持つすべてのラボにシンプルかつ簡単に従順です。アッセイは、〜8倍のダイナミックレンジを持ち、プレートフォーマット5に容易に拡張することができます。
Protocol
Discussion
MassSQUIRMは、モノ – 及びジ – メチル化に関与するリジン脱メチル化酵素活性の包括的な分析のための安価で、定量的な方法です。 MassSQUIRMは、反応生成物のだけでなく、中間体だけでなく、定量化を提供しています。このアッセイは、LSD1や他のヒストン脱メチル化のメカニズムを研究する上で強力なツールとして使用することができます。それはまた、PHF8などの多くの新たに発見されたリジ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は質量分析をサポートするためUAMSプロテオミクス施設に感謝します。このプロジェクトの資金は、NIHの助成金P20RR015569、P20RR016460とR01DA025755によって提供されました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Referencias
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