Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit
Summary
We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.
Abstract
Onlangs hebben epigenetische regelgevende instanties zijn ontdekt als belangrijke spelers in een groot aantal verschillende ziekten 1-3. Als gevolg hiervan, deze enzymen zijn primaire doelen voor kleine molecule studies en de ontwikkeling van geneesmiddelen 4. Veel epigenetische regelgevende instanties hebben pas sinds kort ontdekt en zijn nog steeds in het proces worden gekwalificeerd. Onder deze enzymen lysine demethylases die methylgroepen uit lysines op histonen en andere eiwitten. Door de nieuwe karakter van deze klasse van enzymen, weinig assays ontwikkeld om de activiteit te bestuderen. Dit is een blokkade om zowel de indeling en hoge doorvoer studie van histon demethylases. Op dit moment zeer weinig demethylase testen bestaan. Degenen die wel bestaan, hebben de neiging om kwalitatief van aard en kan niet tegelijkertijd onderscheid maken tussen de verschillende lysine-methylatie staten (un-, mono-, di-en tri-). Massaspectrometrie wordt vaak gebruikt om demethylase activiteit te bepalen, maar de huidige massaspectrometrische analyses te doenniet in op de vraag of differentieel gemethyleerd peptiden anders ioniseren. Differentiële ionisatie van gemethyleerde peptiden maakt het vergelijken van methylatie staten moeilijk en zeker niet kwantitatief (figuur 1a). Zo beschikbare tests zijn niet geoptimaliseerd voor de uitgebreide analyse van demethylase activiteit.
Hier beschrijven een methode MassSQUIRM (massaspectrometrische kwantificering met isotopen reductieve methylering) die is gebaseerd op de reductieve methylering van aminegroepen met gedeutereerde formaldehyde dwingen alle lysines zijn di-gemethyleerde, waardoor zij in wezen dezelfde chemische stof en derhalve de ioniseren zelfde (figuur 1b). Het enige verschil chemische na reductieve methylering waterstof en deuterium, die geen invloed MALDI ionisatie efficiëntie. De MassSQUIRM assay is specifiek voor demethylase reactieprodukten met on-mono-of di-methyl lysines. De test is ook van toepassing op lysine-methyl-geven van de same reactieproducten. Hier wordt een combinatie van reductieve methylering chemie en MALDI massaspectrometrie van de activiteit van LSD1 meten, een lysine demethylase kan verwijderen di-en mono-methyl groepen, een synthetisch peptide substraat 5. Deze test is eenvoudig en lastig om een lab toegang tot een MALDI massaspectrometer lab of via een proteomics faciliteit. De test heeft ~ 8-voudige dynamisch bereik en is gemakkelijk schaalbaar tot plaat-formaat 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM is een goedkope en kwantitatieve methode voor een uitgebreide analyse van de activiteit van lysine demethylases betrokken bij de mono-en di-methylatie. MassSQUIRM biedt kwantificering niet alleen van het product van de reactie, maar ook voor de tussenproducten. Deze test kan worden gebruikt als een krachtig middel bestuderen het mechanisme van LSD1 en histon demethylases. Het is ook bruikbaar voor de indeling vele nieuw ontdekte lysine demethylase enzymen zoals PHF8 en kunnen worden gebruikt voor bepaalde met…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de UAMS Proteomics Faciliteit voor massaspectrometrische ondersteuning. De financiering voor dit project werd verzorgd door NIH subsidies P20RR015569, P20RR016460 en R01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
Referencias
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genética. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
