Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Summary

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Abstract

Fate kaarten opgebouwd uit stam tracering alle cellen van een embryo, blijkt dat weefsels afstammen van elke cel van de embryo. Hoewel lot kaarten zijn zeer nuttig voor het identificeren van de voorlopers van een orgaan en voor het ophelderen van de ontwikkelingstraject waarbij de afstammeling cellen die organen bevolken de normale embryo, ze illustreren de volledige ontwikkelingspotentieel van een precursor cel of identificeren mechanismen waarmee het lot bepaald. Om te testen voor lot van de cel inzet, men vergelijkt een cel normale repertoire van nakomelingen in het intacte embryo (het lot kaart) met die uitgedrukt na een experimentele manipulatie. Is de cel het lot bepaald (vastgelegd), ongeacht de omringende cellulaire omgeving, of is het beïnvloed door externe factoren die door zijn buren? Met behulp van de uitgebreide lot kaarten van de Xenopus embryo beschrijven we hoe te identificeren, isoleren en cultuur een decollete stadium precursoren, genoemd blastovennen. Deze benadering maakt het mogelijk om te beoordelen of deze eerste cellen zijn toegewijd aan het lot zij in hun normale omgeving verwerven in het intacte embryo vereisen interacties met naburige cellen, of kan worden beïnvloed alternatieve lot drukken bij blootstelling aan andere soorten signalen.

Introduction

Xenopus laevis embryo's zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen die embryonale cellen krijgen hun specifieke lot omdat hun eieren groot genoeg om microchirurgische benaderingen mogelijk identificeren. Bovendien ontwikkelen ze buiten zonder voedingssupplementen van het kweekmedium omdat elke cel een rijke intracellulaire levering van dooier bloedplaatjes die een intrinsieke energie store. Een belangrijk voordeel voor het bestuderen van de mechanismen waarmee lot van de cel wordt bepaald is een uitgebreide reeks lot kaarten van de splitsing fase blastomeren (van 2 – tot 32-cell fasen) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} De kaarten werden geconstrueerd door microinjecting een detecteerbaar molecuul in een, identificeerbaar blastomeer en controle later in ontwikkeling die weefsels worden bevolkt door de gemerkte nageslacht. Consistent lot kaarten zijn mogelijk omdat de kardinaal assen van de embryo betrouwbaar kan worden geïdentificeerd in vele Embryos. Ten eerste, in alle wild-type embryo's het dier halfrond is gepigmenteerd, terwijl de plantaardige halfrond is het niet. Anderzijds de ingang van het sperma bij bevruchting vindt een contractie van het dier halfrond pigmentatie naar de toekomst buikzijde, in veel embryo's een pigmentatie verschil kan daarom gebruikt worden om onderscheid te maken tussen dorsale en ventrale kanten. Derde, de eerste splitsplek vore benadert het sagittale middenvlak in de meeste embryo's, en kan dus worden gebruikt om de rechter-en linkerzijde van de embryo identificeren. Het lot kaarten zijn ook afhankelijk van het feit, dat op natuurlijke wijze bevruchte eieren vaak aankleven in regelmatige patronen die elke blastomeer identificeerbare over een grote populatie van embryo's. Hoewel er variabiliteit binnen en tussen legsels van eieren ten aanzien van pigmentatie en decollete patronen, met behulp van selectieprocedures die hierin worden beschreven kunnen cellen met voorgeschreven lot te worden geïdentificeerd met ongeveer 90% nauwkeurigheid.

Celtypes kunnen afschrikkenbepaald tijdens embryogenese door verschillende mechanismen. Intrinsieke factoren, zoals erfelijke differentieel cytoplasmatische mRNA of eiwitten, bijdragen tot verschillende aspecten van vroege patronen. Bijvoorbeeld specifieke maternale mRNA bepalen welke cellen bijdragen aan de kiemlijn, worden de endoderm, of bijdragen aan de dorsale lichaamsas (beoordeeld in ^7). Extrinsieke factoren lokaal door naburige cellen of verder af van een embryonale signalering centrum verantwoordelijk voor het induceren van specifieke weefselsoorten en patroonvorming vrijwel elk orgaansysteem. Voorbeelden van signalering centra zijn ook de organisator / node in de gastrula dat de neurale ectoderm en patronen het mesoderm induceert, en de zone van polariserende activiteit die patronen van de anterior-posterior as van de ledematen. Hoewel lot maps identificeren voorlopers van de verschillende organen en onthullen de ontwikkeling weg die hun nakomelingen in normale embryo, kunnen ze geen onderscheid tussen intrinsiekeen extrinsieke invloeden op deze cellen. Ook blijkt dat er geen volledige ontwikkeling van een cel, die nakomelingen differentiëren in het complex signaleren omgeving van de embryo. Twee experimentele benaderingen kunnen testen of een cel lot bepaald door intrinsieke factoren of daarna beïnvloed door externe factoren: 1) transplantatie van de cel naar een nieuwe locatie in het embryo, of 2) verwijderen van de cellen van de embryo, gevolgd door kweek in afwezigheid van exogeen signalen.

Beide experimentele benaderingen zijn mogelijk in Xenopus omdat de cellen groot genoeg om handmatig gescheiden. Zo hebben vele studies verwijderd enkele cellen van embryo's (tot cel-cel interacties veranderen) of getransplanteerde cellen op nieuwe plaatsen in ontvangende embryo's testen lot veranderingen (beoordeeld in ^{7, 8, 9).} Bovendien de tweede benadering van explanteren kleine aantallen cellen van verschillende gebieden van de embryo into cultuur inductieve weefsel interacties in de afwezigheid van exogene factoren verduidelijken is mogelijk omdat de cellen van het Xenopus embryo zijn gevuld met een intracellulaire voedingsstof store, de dooier bloedplaatjes. Daarom kunnen ze worden gekweekt een paar dagen in een gedefinieerd medium zonder zout nutritioneel of groeifactor aanvulling van het kweekmedium. Wij hebben deze benadering te laten zien dat dorsale dier blastomeren een autonome vermogen om neurale en dorsale mesodermale weefsels door maternaal overgeërfd mRNAs ^{10, 11} produceren en anderen aangetoond dat mesoderm specificatie van 32-cell blastomeren gebeurt zowel intrinsieke als extrinsieke informatie ¹² . Een voordeel van het kweken van cellen als explantaten is dat het medium ook kan worden aangevuld met gedefinieerde signaalfactoren te bepalen welke cel-tot-cel communicatie pathway kan het lot van de geëxplanteerde cel ^{12, 13, 14} beïnvloeden. Daarnaast kan men injecteren de blastomeer prior om cultuur mRNA tot overexpressie een gen, of anti-sense oligonucleotiden de vertaling van endogene mRNA's te voorkomen. Deze, winst-en verlies-van-functie analyses kunnen bepalen welke moleculen nodig zijn voor een autonoom uitgedrukt lot. Het lot van het explantaat te analyseren, kan de identificatie van specifieke celtypen worden uitgevoerd door standaard genexpressie (bijvoorbeeld in situ hybridisatie, RT-PCR) en immunocytochemische assays. Dit protocol biedt een eenvoudige, maar krachtige, manier om onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke mechanismen die regelen hoe een embryonale cel zich ontwikkelt tot specifieke weefsels.

Protocol

1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en Gerechten Verscherpen vier tang met behulp van Alumina schurende film. Doe dit onder een dissectiemicroscoop aan het uiteinde formaat te controleren. Een pincet dient als back-up bij een tip wordt beschadigd tijdens de procedure. Autoclave vier forceps en bewaar in een steriele container. Maak 500 ml elk van 0,1 x en 1,0 x kweekmedium (ofwel Marc's gemodificeerd Ringers [MMR] of zoutoplossing Gewijzigd Barth's [MBS]; recepten in 15)</s…

Representative Results

Het vermogen van deze assay goed te beoordelen ontwikkeling van de cel berust op de juiste ontleden blastomeer gebaseerd op het lot kaarten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daarom is het essentieel om embryo's te kiezen met de juiste pigmentatie patroon op de 2-cel stadium, zoals geïllustreerd in figuur 1, die vervolgens overeenstemming regelmatig splitsingspatronen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Als men neemt de gesorteerd embryo's bij het bereiken van de vereiste decollete po…

Discussion

De belangrijkste stappen voor een succesvolle kweken van afzonderlijke blastomeren zijn: 1) het identificeren van de juiste plaats blastomeer, 2) het behoud van een steriele, gezonde cultuur 3) ontleden cellen op het juiste deel van de celcyclus en 4) de noodzakelijke handmatige behendigheid om beschadiging tijdens dissectie en goed te dragen aan de cultuur.

Te manipuleren specifieke blastomeren is essentieel om de assen kardinaal identificeren. In Xenopus embryo kan de rugzijde wor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use