Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Summary

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Abstract

Mapas de destino, construídos a partir da linhagem de rastreamento de todas as células de um embrião, revelam que os tecidos descendem de cada célula do embrião. Embora os mapas destino são muito úteis para a identificação de precursores de um órgão e para elucidar o caminho de desenvolvimento pelo qual as células descendentes povoar o órgão do embrião normal, não ilustram o potencial de desenvolvimento de uma célula precursora ou identificar os mecanismos pelos quais seu destino é determinado. Para testar compromisso destino da célula, se compara repertório normal de uma célula de descendentes no embrião intacto (o mapa destino) com os indicados depois de uma manipulação experimental. É o destino da célula fixo (comprometido), independentemente do meio ambiente celular, ou é influenciada por fatores externos prestados por seus vizinhos? Usando os mapas destino abrangentes do embrião de Xenopus, descrevemos como identificar, isolar e cultura precursores de estágio único de clivagem, chamado Blastomeres. Esta abordagem permite avaliar se estas células iniciais estão comprometidos com o destino que elas adquirem no seu meio ambiente normal em que o embrião intacto, requerem interacções com as suas células vizinhas, ou pode ser influenciada para expressar destinos alternativos, se forem expostos a outros tipos de sinais.

Introduction

Embriões de Xenopus laevis foram utilizados extensivamente para identificar os mecanismos pelos quais as células embrionárias adquirem os seus destinos específicos, porque os ovos são suficientemente grandes para permitir que as abordagens de microcirurgia. Além disso, desenvolvem-se externamente, sem a necessidade de suplementação nutricional do meio de cultura uma vez que cada célula contém uma fonte rica intracelular de plaquetas gema que proporcionam um armazenamento de energia intrínseca. Um trunfo importante para o estudo dos mecanismos pelos quais o destino da célula é determinado é o conjunto completo de mapas destino dos blastômeros estágio de clivagem (de 2 a 32 – de células-estágios) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Estes mapas foram construídos por microinjecting uma molécula detectável em um blastômero, único de identificação e monitoramento mais tarde no desenvolvimento que os tecidos são preenchidos pela descendência rotulados. Mapas destino consistentes são possíveis porque os eixos fundamentais de os embriões podem ser identificados de forma confiável em muitos embryOS. Em primeiro lugar, em todos os embriões de tipo selvagem para o hemisfério animal é pigmentada, enquanto que o hemisfério vegetal não é. Em segundo lugar, a entrada do esperma no momento da fertilização provoca uma contracção da pigmentação hemisfério animal para o lado ventral futuro, em muitos embriões diferença pigmentação, portanto, pode ser utilizado para discriminar entre os lados dorsal e ventral. Em terceiro lugar, o sulco de clivagem primeiro se aproxima do plano sagital mediano na maioria dos embriões, e portanto, pode ser usado para identificar os lados direito e esquerdo do embrião. Os mapas destino também confiar no fato de que, naturalmente, ovos fertilizados freqüentemente apegar em padrões regulares que fazem cada blastômero identificável através de uma grande população de embriões. Enquanto existe variabilidade dentro e entre garras de ovos quanto aos padrões de pigmentação e clivagem, utilizando procedimentos de selecção descrito aqui permite que as células com destino prescritos para ser identificado com cerca de 90% de precisão.

Destinos celulares podem ser determinadas durante a embriogênese através de vários mecanismos. Fatores intrínsecos, como diferencialmente herdados mRNAs citoplasmáticos ou proteínas, contribuem para vários aspectos de padronização cedo. Por exemplo, os mRNAs específicos maternos determinar quais as células que contribuem para a linha germinal, tornar-se a endoderme, ou contribuir para o eixo do corpo dorsal (revisto em ^7). Factores extrínsecos fornecidos localmente por células vizinhas ou mais distante do centro de uma sinalização embrionária, são responsáveis ​​pela indução de tipos específicos de tecidos e padronização do sistema de quase todos os órgãos. Exemplos de centros de sinalização incluem o organizador / nó na gástrula que induz o ectoderma neural e padrões da mesoderme, e da zona de polarização atividade que os padrões do eixo ântero-posterior do botão do membro. Embora os mapas destino identificar os precursores dos diferentes órgãos e revelar o caminho do desenvolvimento tomadas pelos seus descendentes no embrião normal, eles não conseguem distinguir entre intrínsecae influências extrínsecas sobre essas células. Eles também não revelam de todo o potencial de desenvolvimento de uma célula, cujos descendentes diferenciar no ambiente complexo de sinalização do embrião. Duas abordagens experimentais pode testar se o destino de uma célula é determinada por factores intrínsecos ou seja posteriormente influenciado por factores externos: 1) transplantação de células para um local novo no embrião, ou 2) a remoção da célula a partir do embrião seguido por cultura em ausência de sinais exógenos.

Ambas as abordagens experimentais têm sido viável em Xenopus, porque as células são suficientemente grandes para serem separadas manualmente. Por exemplo, vários estudos têm excluído células individuais de embriões (para mudar interações célula-célula) ou células transplantadas para locais novos, em embriões de acolhimento para testar mudanças Fate (revisada em ^{7, 8, 9).} Além disso, a segunda abordagem da explantar pequeno número de células a partir de diferentes regiões do embrião into cultura para elucidar as interacções indutivas tecido na ausência de factores exógenos é possível porque as células do embrião de Xenopus são preenchidos com um armazenamento intracelular de nutrientes, as plaquetas da gema. Portanto, elas podem ser cultivadas durante alguns dias em um meio de sal definido sem suplementação nutricional ou factor de crescimento do meio de cultura. Nós temos usado essa abordagem para mostrar que blastômeros animais dorsal tem uma capacidade autônoma de produzir tecidos neurais e dorsal mesodérmicas devido a mRNAs herdada da mãe ^{10, 11,} e outros mostraram que a especificação mesoderma de 32 celulares blastômeros depende tanto informações intrínsecas e extrínsecas ¹² . Uma vantagem da cultura de células como explantes é que o meio pode ser suplementado com factores definidos de sinalização a fim de determinar qual a célula-a-célula via de comunicação pode influenciar o destino das células explantadas ^{12, 13, 14.} Além disso, pode-se injetar o pr blastômeroior a cultura com mRNA para sobre-expressar um gene, ou com oligonucleotídeos anti-senso para evitar a tradução de mRNAs endógenos. Estes, ganho e perda de função-análises podem identificar quais as moléculas são necessários para um destino autonomamente expressa. Para a análise do destino do explante, a identificação de tipos específicos de células pode ser realizada por expressão de genes padrão (por exemplo, hibridação de situ, RT-PCR) e ensaios imunocitoquímicos. Este protocolo fornece um simples, mas poderoso maneira, a distinção entre mecanismos intrínsecos e extrínsecos que regulam como uma célula embrionária se desenvolve em tecidos específicos.

Protocol

1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos Afie quatro pinças utilizando filme abrasivo Alumina. Fazer isso sob um microscópio de dissecação para monitorar o tamanho da ponta. Um par de fórceps serve como um back-up no caso de uma dica é danificado durante o procedimento. Autoclave as quatro pinças e armazenar em um recipiente estéril. Faça 500 ml cada de meio de cultura 0,1 X 1,0 X e (ou Modificação de Marc Ringers [MMR] ou salinos Modificado Barth [MBS]; receitas em <sup…

Representative Results

A capacidade deste ensaio para avaliar com precisão a potencial de desenvolvimento das células baseia-se dissecando a blastômero correcta com base no destino de mapas 1, 2, 3, 4, 5, 6. Portanto, é importante escolher os embriões com o padrão de pigmentação correcta na fase 2-célula, como se ilustra na Figura 1, que, posteriormente, em conformidade com padrões de clivagem regulares, conforme ilustrado na Figura 2. Se uma observa os embriões classificadas como chegar…

Discussion

Os passos mais críticos para a cultura bem sucedida de blastômeros individuais são os seguintes: 1) identificar correctamente o blastômero de interesse e 2) manutenção de uma cultura estéril e saudável, 3) as células de dissecação na parte correcta do ciclo celular, e 4) o desenvolvimento do Manual necessário destreza para evitar danos durante a dissecção e transferir para a cultura também.

Para manipular blastómeros específicos, é essencial ser capaz de identificar os eixo…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use